肿瘤类器官构建与药敏检测—从患者来源类器官（PDO）到精准医疗个性化用药

一、精准医疗时代的肿瘤建模困境

    在肿瘤治疗的精准医疗时代，如何为每一位患者选择最有效的治疗方案，始终是临床面临的核心挑战。传统的治疗方案选择往往基于大规模临床试验的统计数据和临床指南推荐，而非个体肿瘤的生物学特征。这种"一刀切"的模式导致了大量无效治疗，患者承受了不必要的毒副作用和经济负担，却未能获得预期的治疗效果。

    要实现真正的个性化用药，需要一个能够准确预测药物疗效的体外模型。然而，传统模型在这方面表现不佳。二维细胞系培养丢失了肿瘤组织的三维结构和细胞异质性，药物反应与临床实际相差甚远。患者来源异种移植（PDX）模型虽然更接近临床，但建模周期长（通常数月）、成本高昂、通量有限，难以满足临床决策的时间窗口。基因工程小鼠模型则因种属差异和建模周期长，更不适合用于个体化指导。

    正是在这一困境中，肿瘤类器官技术展现出了独特的价值。患者来源的类器官（PDO）能够在较短时间内（通常2至4周）从患者肿瘤组织中建立，保留原始肿瘤的细胞异质性和遗传特征，同时具备体外高通量药物筛选的能力。大量临床试验已证实，类器官药敏检测结果与患者实际临床疗效密切相关。越来越多的三甲医院和科研机构正在将这一技术应用于临床服务。2022年，国内专家共识的发布更是为这一技术的规范化应用提供了标准。本文将深入解析肿瘤类器官构建、药敏检测和生物样本库建设的全链条技术体系。

图1：从患者肿瘤组织到类器官构建再到药敏检测的完整流程

 

二、肿瘤类器官的科学定义与独特价值

    患者来源的类器官（PDO）是具有三维结构的体外培养模型，从具有干细胞特征的细胞中自我分化而来，能长期增殖培养，重现原始肿瘤复杂的细胞异质性和空间结构，模拟起源组织的功能和生物学行为，保留病理组织学特征和一些遗传特征，如驱动基因的突变和扩增。

    PDO作为肿瘤研究和药物发现的宝贵平台，其价值主要体现在以下几个方面。第一，精准再现肿瘤起源，作为体外模型，能高度模拟肿瘤的真实状态，包括组织结构、分子特征和细胞组成。第二，构建多样化生物样本库，可建立肿瘤组织起源的活体类器官生物样本库，为大规模药物筛选和新药研发提供丰富的样本资源。第三，体外建模条件可控，能调控营养供给、氧气供应水平和药物暴露，研究这些因素对肿瘤细胞行为的影响。第四，预测临床反应，对不同类型癌症患者的临床反应具有预测作用，是连接实验室与临床的桥梁。第五，可建立转基因模型，能构建转基因肿瘤类器官模型，探究肿瘤基因突变的发生机制。

    PDO与传统模型的关键区别在于其保留了肿瘤异质性。肿瘤并非均一的细胞群体，而是由具有不同遗传背景和表型特征的亚群组成的复杂混合体。这种异质性是肿瘤耐药和复发的根本原因之一。二维细胞系在长期培养过程中会丢失大部分亚群，最终只剩下适应体外条件的优势克隆。而PDO通过三维培养和干细胞自我更新机制，能够保留原始肿瘤中的多个亚群，更真实地反映肿瘤的异质性特征。

    2022年7月，美国FDA基于器官芯片模型的临床前疗效结果，首次批准Sutimlimab开始临床试验，且无需依赖传统的体内实验数据。这一里程碑事件标志着类器官和器官芯片技术开始获得监管机构的正式认可，为其在药物研发中的广泛应用打开了大门。

 

三、患者来源类器官（PDO）的构建流程

    肿瘤类器官构建是一个多步骤的精细过程，每一步都对最终类器官的质量和可用性产生重要影响。标准的PDO构建流程通常包括样本获取、组织处理、细胞接种、培养建立和质控鉴定五个阶段。

    样本获取是构建的第一步，也是决定成败的关键。样本来源包括手术切除的肿瘤组织、穿刺活检样本、胸腹水中的肿瘤细胞，甚至可以来源于患者来源异种移植（PDX）组织。手术样本需要选取富含肿瘤细胞的区域，避开坏死组织。样本获取后必须尽快转运至实验室，使用专用组织保存液维持细胞活性。样本的缺血时间和转运条件直接影响后续培养成功率，缺血时间越长，细胞活性越低，类器官出芽率越差。

    组织处理阶段包括机械剪碎和酶消化。将肿瘤组织在无菌条件下剪碎至1至2立方毫米的小块，然后用消化酶（如胶原酶、分散酶等）在37℃下消化，将组织解离为单细胞或小细胞团。消化程度的控制是一个需要经验积累的技术活，消化过度会把细胞打得太碎，导致活性下降；消化不足则细胞团过大，影响后续接种和生长。消化后需要通过细胞筛网过滤，收集合适大小的细胞团块用于接种。

    细胞接种是将处理好的细胞与液态基质胶混合，以液滴法接种到培养板中。基质胶在37℃下凝固，形成三维支架，细胞在其中自组装形成类器官结构。接种密度需要根据肿瘤类型和细胞活性进行优化，密度过低类器官生长缓慢，密度过高则可能导致营养不足和中心坏死。接种后加入特定器官类型的类器官完全培养基，放入37℃、5% CO2培养箱中培养。通常在接种后3至7天可以观察到类器官的初步形成。

    质控鉴定是确保PDO质量的最后一道关卡。HE染色用于确认类器官是否保留了来源肿瘤的组织学特征；免疫组化（IHC）和免疫荧光用于验证特异性标志物的表达；全外显子测序（WES）或qPCR用于检测关键基因突变和扩增的保留情况。只有通过全套质控的PDO，才能进入下游的药敏检测和临床应用环节。从样本获取到质控完成，整个构建周期通常为2至4周，远短于PDX模型的数月周期。

图2：PDO构建流程，从肿瘤组织获取到类器官形成与质控鉴定

 

四、肿瘤异质性在类器官中的保留与再现

    肿瘤异质性是肿瘤生物学中最核心也最具挑战性的概念之一。同一肿瘤内部不同区域的细胞可能具有不同的基因突变谱、不同的药物敏感性和不同的转移潜能。这种空间异质性是肿瘤耐药和复发的根源，对一种药物敏感的亚群被杀死后，耐药亚群可能存活并重新增殖。传统的二维细胞培养在建立过程中会丢失大部分亚群，最终只剩下适应体外条件的优势克隆，无法反映肿瘤的真实复杂性。

    PDO在保留肿瘤异质性方面具有显著优势。研究显示，通过空间多点取样构建的PDO能够反映同一肿瘤不同区域的异质性特征。从同一肿瘤的不同区域分别建立类器官，可以发现各区域类器官在基因突变谱和药物敏感性上的差异，为理解肿瘤内部异质性提供了有力工具。这种能力使得PDO成为研究肿瘤进化和耐药机制的理想模型。

    除了空间异质性，PDO还能保留肿瘤的时间异质性，即肿瘤随时间推移和治疗压力发生演化的特征。通过对同一患者在不同治疗阶段建立的PDO进行比较，可以追踪肿瘤克隆演化轨迹，揭示耐药克隆的起源和演化路径。这种纵向追踪能力对于理解肿瘤耐药机制和制定序贯治疗策略具有重要意义。

    PDO保留异质性的程度也受到培养条件的影响。类器官在长期传代过程中，某些适应体外条件的亚群可能逐渐成为优势群体，而其他亚群可能被丢失。因此，对于需要保留异质性的研究，应尽量使用早期传代的类器官（通常P1至P3代），并建立冻存库以保存原始异质性。同时，可以通过单细胞测序等技术对类器官的细胞组成进行动态监测，确保异质性的保留程度。

 

五、类器官药敏检测的技术原理与流程

    类器官药敏检测（DST）是将构建成功的PDO用于评估不同药物对肿瘤细胞杀伤效果的技术。其核心原理是：将PDO接种到多孔板中，暴露于不同浓度的候选药物，通过检测类器官的活力变化来定量评估药物敏感性。整个过程可以概括为样本获取、药物筛选和数据分析三个步骤。

    药物筛选的实验设计是DST的核心环节。板型一般选择96孔或384孔，384孔省试剂、通量高，但对加样精度和成像系统要求也高；96孔容错更好，适合起步。浓度梯度通常设置8至10个浓度点，按3倍稀释递进，覆盖从无效到完全抑制的区间。例如从100微摩尔往下稀释，能同时捕捉到IC50和平台区。实验必须设置完善的对照组：阴性对照（含等量溶剂如DMSO的培养基）排除溶剂本身毒性；阳性对照（已知对该模型敏感的药物）验证系统正常；空白对照（只有基质胶和培养基）用于成像背景扣除。生物学重复至少n大于等于3，给药后孵育时间多为48至72小时，代谢慢的药物可能需要延长。

    给药结束后的读出方法是DST的另一个关键环节。最常用的是基于细胞活力的生化检测方法，如ATP活性检测或CCK-8法，通过吸光度或荧光信号反映类器官的代谢活力。成像量化法则通过高内涵成像系统对类器官的形态、大小和荧光信号进行定量分析，能够提供更丰富的药效信息，不仅知道"死了多少"，还能看到"怎么死的"：是缩小了、碎裂了，还是只是停止生长。两种方法各有优势，实际应用中常结合使用以获得更全面的药效数据。

    一个实用建议是铺板时把每板的边缘孔留作空白或对照。边缘孔蒸发快、温度略高，数据系统性偏低，这是多孔板永远的"边缘效应"，靠设计绕开比靠后期校正更稳。数据分析阶段需要将药物浓度与活力数据进行曲线拟合，计算IC50、AUC等药效参数，并根据预设的敏感性阈值将患者分类为"敏感"或"耐药"。

 

六、类器官药敏检测的临床应用证据

    类器官药敏检测的临床应用价值已获得大量临床研究数据的支持。由国内多家三甲医院和研究机构专家共同参与完成的共识，发表在《Theranostics》（影响因子12.4）期刊上，深入探讨了类器官药物敏感性检测在肿瘤精准医疗和药物研发中的应用。

    共识推荐类器官高通量药物筛选检测用于多种原发性及转移性实体恶性肿瘤患者，包括但不限于呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、神经系统、皮肤、头颈部及淋巴结原发和（或）转移性实体肿瘤等（I类推荐）。不同治疗方式或治疗阶段的实体肿瘤患者均可以构建类器官药物筛选模型，包括初诊患者、二线及以上治疗患者、复发转移患者等。

    大量临床试验表明，类器官药敏检测结果与患者实际临床疗效密切相关。将PDO-DST整合到临床试验中，可以作为临床治疗反应的预测生物标志物。医生可以根据类器官对不同药物的敏感性，为患者选择最有可能有效的治疗方案，提高治疗成功率，减少无效治疗带来的副作用和经济负担。截至2023年9月，ClinicalTrials.gov上已注册了159个与类器官相关的癌症研究项目，涵盖多种癌症类型，充分体现了类器官在临床试验中的应用潜力。

    类器官DST在临床服务中已开始应用于为癌症患者提供个性化治疗指导。医生可以根据患者肿瘤类器官对不同药物的反应，制定更精准的化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗和联合治疗方案。共识还强调了类器官在罕见恶性肿瘤、耐药肿瘤和新靶点发现中的独特价值，PDO非常适合研究罕见恶性肿瘤、尚无现有模型的肿瘤和耐药肿瘤。

类器官药敏检测的临床应用场景

1. 初诊患者的方案选择，为首次治疗提供药敏依据

2. 二线及以上治疗患者的方案调整，寻找耐药后的替代方案

3. 复发转移患者的用药指导，针对新发肿瘤重新药敏

4. 罕见肿瘤的个性化治疗，缺乏标准方案时的个体化探索

5. 联合用药方案优化，筛选最优药物组合

图3：类器官药敏检测，剂量-效应曲线与IC50分析的多孔板筛选

 

七、类器官生物样本库的建设与意义

    类器官生物样本库是类器官技术产业化的基础设施。一个高质量的类器官生物样本库，能够为药物研发、基础研究和精准医疗提供丰富的活体样本资源，是连接临床与科研、个体与群体的关键桥梁。

    类器官生物样本库的核心价值在于"活体保存"。与传统病理样本库（以福尔马林固定石蜡包埋组织为主）不同，类器官库保存的是活的、可扩增的、可复苏的细胞群体。这意味着研究者不仅可以从库中获取样本进行基因组学分析，还可以直接用这些活体样本进行药物筛选、功能验证和机制研究。类器官库的建立使样本从"一次性消耗品"变成了"可再生的研究资源"。

    类器官生物样本库需要系统化的标准操作流程。入库环节包括样本的临床信息采集（病理诊断、分期、治疗历史等）、类器官构建和质控鉴定、传代扩增和冻存。冻存采用无血清冻存液，在液氮中长期保存，需要时复苏即可恢复培养。出库环节需要记录样本的使用去向和研究成果，确保样本的溯源性。整个库的管理需要信息化系统支持，实现样本的编码、存储位置、质控数据、使用记录等的全程追踪。

    国际领先的类器官生物样本库以荷兰Hubrecht Organoid Technology（HUB）为代表。HUB基于Clevers团队的技术，建立了覆盖多种肿瘤类型的患者来源类器官生物样本库，并与多家制药公司合作开展药物筛选。默克等跨国药企已获得HUB平台的独家使用授权，利用其类器官样本库和筛选方法开发服务进行新药研发。国内也在积极建设类器官生物样本库，覆盖肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等主要瘤种，为国内药物研发和精准医疗提供样本支撑。

    类器官生物样本库的建设还面临着标准化和互认的挑战。不同机构建立的类器官库在样本来源、培养条件、质控标准等方面存在差异，库间数据的互认和共享需要统一的技术标准。国内专家共识的发布为这一问题提供了方向—《肿瘤类器官诊治平台的质量控制标准中国专家共识（2022年版）》对类器官构建、培养、鉴定和药敏检测的全流程质量控制提出了明确要求，为类器官库的标准化建设奠定了基础。

 

八、从实验室到临床

    肿瘤类器官技术正经历从实验室研究到临床应用的深刻跨越。患者来源类器官以其保留肿瘤异质性、可高通量药物筛选、建模周期短等独特优势，成为连接基础研究与临床决策的重要桥梁。类器官药敏检测作为这一跨越的核心应用，已获得大量临床证据的支持和专家共识的认可，正在从"前沿探索"走向"常规服务"。

    类器官药敏检测的标准化程度有待提升，不同机构在培养条件、检测方法和数据分析上存在差异，影响了结果的可比性和互认。类器官模型在模拟肿瘤微环境方面的局限性也需要关注，目前的PDO主要由上皮细胞构成，缺乏免疫细胞、间质细胞和血管系统的参与。为解决这一问题，研究者正在探索将免疫细胞、成纤维细胞等与类器官共培养的复杂模型，以及类器官与器官芯片结合的微流控系统。

    随着NMPA开放类器官非临床数据试点、医保新增肿瘤类器官检测收费项目，类器官药敏检测的临床应用环境正在快速改善。越来越多的三甲医院开始建立类器官检测平台，越来越多的患者开始从这一技术中获益。在这个精准医疗加速落地的时代，肿瘤类器官构建和药敏检测正成为推动个体化治疗走向现实的新引擎。

图4：类器官生物样本库，活体保存、可扩增可复苏的肿瘤研究资源库