客户文章分享:在假单胞菌pf- 5中Hfq对lipA表达的调控作用

信息来源:金开瑞 作者:genecreate 发布时间:2017-12-14 16:25:22

题目:The role of Hfq in regulation of lipA expression in Pseudomonas protegens Pf-5
期刊:Scientific Reports
影响因子:4.847   4.259
合作技术:EMSA

研究背景
       脂肪酶是一种重要的工业酶,它存在于多种动物、植物和微生物中。商业脂肪酶主要来源于微生物。目前,脂肪酶被用于食品、饮料、石油、洗涤剂、化妆品、纸张、污染控制和生物能源工业。然而,传统发酵条件的优化也不能克服细菌脂肪酶的生产过程中的问题。因此为了解决这些问题,有必要阐明其对脂肪酶的基因表达调控的分子机制。
       假单胞菌脂肪酶是一种被研究的较清楚的脂肪酶。然而很少有针对脂肪酶表达调控的机制进行研究。Hfq是一种广泛调控蛋白,能够影响细菌生存的各种生理过程,控制多种基因的表达,调节细菌的蠕动,参与细菌群感应系统的管理。在本研究中,通过敲除或过表达hfq和rsmY基因,研究Hfq对脂肪酶表达的调控。研究发现,Hfq在转录水平和翻译水平调节脂肪酶的表达,主要表现在转录水平的调控。同时Hfq还调控rsmY的表达及维持rsmY的稳定性。将Hfq / rsmY双基因敲除,发现hfq可以直接结合rsmY来调控脂肪酶的激活。总之,这项研究表明在假单胞菌pf - 5中,Hfq通过在转录水平上调控rsmY的表达来影响脂肪酶的表达。

研究内容及结果
       为了研究Hfq和lipA之间的关系,本文先通过同源重组的方法敲除及突变hfq基因,得到四个基因的突变株。并通过PCR的方法检测基因敲降成功。将hfq突变后检测了Pf-5的生长、脂肪酶的表达及活性,同时检测了β-半乳糖苷酶的活性。实验结果显示hfq被突变后,单胞菌Pf-5生长水平受到抑制,脂肪酶转录水平表达受到抑制,同时脂肪酶活性显著降低,β-半乳糖苷酶的活性也显著降低。
       在野生型假单胞菌pf- 5中,通过同源重组的方法过表达hfq,恢复了hfq突变体中脂肪酶的相对活性,结果表明hfq基因敲除在启动子水平上影响脂肪酶表达以及活性。此外,在hfq突变型中过表达hfq后检测脂肪酶和β-半乳糖苷酶的活性,结果显示与野生型相比,这两种酶的活性都恢复了。这些结果说明hfq在转录水平和翻译水平参与lipA的表达以及脂肪酶表达的调控。
        将phrs、rsmA,rsmE、remY、rsmZ的启动子构建到lacZ报告基因的启动子区域,转染进hfq敲降后的假单胞菌,检测β-半乳糖苷酶活性。结果显示,转染phrs、rsmA,rsmE重组质粒后β-半乳糖苷酶的活性没有变化,rsmZ的活性发生了轻微的变化,而rsmY的活性变化很明显。这些结果表明hfq可能通过remY或rsmZ影响lipA的表达。
        使用纯化后的hfq蛋白,通过EMSA实验进一步研究hfq与rsmY是否结合。EMSA实验结果显示hfq不能与rsmA、rsmE、rsmZ的启动子序列结合,但是可以与rsmY结合。竞争性EMSA实验结果显示,随着非标记rsmY探针浓度增加,与hfq蛋白结合的标记探针越来越少,这个结果说明hfq蛋白可以与rsmY结合。
        据报道,Hfq和rsmY的结合可以维持rsmY的稳定。然而,在pf - 5中,Hfq没有被研究过。因此本文先研究了利福平处理后,pf-5野生型和hfq突变株中rsmY的稳定性变化。结果表明,与野生型相比,hfq突变体中rsmY的稳定性明显降低。这个结果显示Hfq通过调节rsmY的稳定性来影响表达rsmY,进而影响脂肪酶的表达。
       通过PCR确定rsmY基因被敲除后(图6A),对脂肪酶表达进行了测定,验证了rsmY在调节脂肪酶表达中的作用。实验结果hfq被敲除的细胞中脂肪酶表达量减少。hfq和rsmY 都被敲除的细胞内,脂肪酶表达量显著下调(图6B和C)。此外,在hfq突变体中,将rsmY恢复表达,结果显示脂肪酶的表达水平与野生型表达水平相似。在野生型和hfq突变型菌株中,过表达rsmY后lipA的表达水平都显著上调。
文章小结
1. Hfq基因被敲降后,pf-5菌株中脂肪酶的表达量显著下调,同时细菌生长受到抑制,说明hfq调控lipA的表达和脂肪酶的活性。
2. hfq可能通过remY或rsmZ影响lipA的表达。
3. EMSA实验表明hfq蛋白可以与rsmY结合。
4. Hfq通过调节rsmY的稳定性来影响表达rsmY,进而影响脂肪酶的表达。
5. Hfq通过在转录水平上调控rsmY的表达来影响脂肪酶的表达。

解析文献
Wu Liu, Menggang Li, et al. The role of Hfq in regulation of lipA expression in Pseudomonas protegens Pf-5. Scientific. Reports. 7 (1) :10356(2017).
参考文献
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4. Rosenau, F. & Jaeger, K. Bacterial lipases from Pseudomonas: regulation of gene expression and mechanisms of secretion. Biochimie82, 1023–32 (2000).




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