表面等离子共振(SPR)是分子互作检测的金标准

    表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR） 被公认为生物分子相互作用分析的“金标准”，主要是因为它能够在无需标记（Label-free）的情况下，实时、原位地监测分子间的结合过程，并提供精确的动力学参数和亲和力数据。
在药物研发、基础生物学研究以及质量控制领域，SPR 技术占据着不可替代的核心地位。以下是对其作为“金标准”的深度解析：

 

1. 核心原理：光学的“天平”

SPR 技术的物理基础是表面等离子体共振现象。

    传感器芯片：核心是一个镀有金膜的玻璃芯片。

    固定配体：将其中一个分子（配体，Ligand）固定在芯片表面的金膜上。

    流动分析物：让另一个分子（分析物，Analyte）流过芯片表面。

    信号产生：当分析物与配体结合时，芯片表面的折射率（Refractive Index）会发生微小变化。这种变化会导致反射光的角度发生偏移（共振角改变）。

    实时监测：仪器通过检测反射光角度的变化，将其转化为响应单位（RU），从而实时绘制出结合和解离的曲线（传感图，Sensorgram）。

关键点：整个过程不需要对分子进行荧光、放射性或酶标记，避免了标记可能引起的分子结构改变或活性丧失。

2. 为什么它是“金标准”？（核心优势）

    SPR 之所以被称为金标准，是因为它能提供其他技术（如 ELISA、ITC、BLI）难以同时具备的完整信息：

（1）实时动力学监测 (Real-time Kinetics)

    这是 SPR 最强大的功能。它不仅能告诉你分子“是否”结合，还能告诉你“如何”结合：

    结合速率常数 ( konkon​ / kaka​ )：分子结合有多快？反映了扩散限制和取向效应。

    解离速率常数 ( koffkoff​ / kdkd​ )：分子分开有多快？这是药物药效的关键指标。通常 koffkoff​ 越慢（解离越慢），药物在体内的滞留时间越长，药效往往越好。

    其他技术局限：ELISA 只能测终点信号，无法区分是结合快还是解离慢；ITC（等温滴定量热法）虽然也能测动力学，但对低亲和力或快速动力学的体系分辨率不如 SPR。

 

（2）精确的亲和力测定 (Affinity, KDKD​ )

    通过 KD=koff/konKD​=koff​/kon​ 计算得出的平衡解离常数，范围极宽（从 pM 到 mM），覆盖了绝大多数生物相互作用的强度。由于是基于动力学计算而非简单的平衡点拟合，其准确性极高。

 

（3）无需标记 (Label-free)

    保持分子的天然构象和活性。

    省去了繁琐的标记步骤，缩短了实验周期。

    避免了标记物（如荧光基团）对结合位点的空间位阻干扰。

 

（4）样品消耗量少

    现代高灵敏度 SPR 仪器仅需微升（μL）级别的样品和微克（μg）级别的蛋白即可完成高质量的数据采集，这对于珍贵的早期药物候选分子尤为重要。

 

（5）丰富的应用模式

    除了简单的 1:1 结合，SPR 还能解析复杂的相互作用机制：

    竞争结合实验：判断两个抗体是否结合在同一表位（Epitope Binning），这是抗体药物筛选的关键步骤。

    多价结合/协同效应：分析多特异性抗体或复合物的形成。

    浓度测定：利用已知亲和力的配体，反向测定未知样品的活性浓度（比传统的 Bradford 或 BCA 更准确，因为它测的是“有活性的”分子）。

 

3. 与其他技术的对比

特性	SPR (表面等离子共振)	BLI (生物膜干涉)	ITC (等温滴定量热法)	ELISA
标记需求	无标记	无标记	无标记	需标记 (酶/荧光)
动力学参数	极高精度	中等精度 (受扩散限制影响大)	有限 (适合慢反应)	无 (仅终点)
亲和力范围	宽 (pM-mM)	中宽 (nM-μM较佳)	窄 (nM - μM)	窄 (定性/半定量)
通量	中 (取决于通道数)	高 (可并行多个探头)	低	高
流体环境	微流控 (控制精确，但易气泡干扰)	dipping 式 (操作简单，易蒸发)	滴定池	孔板
主要定位	确证性金标准，法规申报首选	快速筛选，粗测	热力学参数 ( $ \Delta H, \Delta S $ )	常规定性/定量

4. 局限性与挑战

尽管是金标准，SPR 并非完美：

    质量传输限制 (Mass Transport Limitation)：如果固定量过高或流速过慢，结合速率可能受限于分子扩散到表面的速度，而非真实的结合速率。需要精心优化实验条件。

    非特异性吸附：复杂样品（如血清、细胞裂解液）可能在芯片表面非特异性吸附，产生假阳性信号。需要严格的对照和表面封闭。

    再生困难：寻找既能洗脱结合物又不破坏固定配体活性的“再生缓冲液”往往需要大量的摸索。

    设备与维护成本：高端 SPR 仪器昂贵，且对操作人员的技能要求较高（芯片选择、偶联化学、数据分析模型选择）。

 

5. 应用场景：从实验室到药监局

    抗体药物开发：

        筛选：从杂交瘤或噬菌体库中筛选高亲和力抗体。

        表位作图 (Epitope Binning)：确定不同抗体结合的位点是否重叠，指导抗体鸡尾酒疗法或双抗设计。

        人源化评估：确保人源化过程未降低亲和力。

    小分子药物筛选：检测小分子与靶蛋白的结合（虽然信号小，但高灵敏度 SPR 可检测）。

    生物类似药 (Biosimilars)：证明生物类似药与原研药具有高度相似的结合动力学特征，是监管机构（如 FDA、NMPA）审批的关键数据。

    诊断试剂开发：验证抗原 - 抗体配对的特异性和亲和力。

    表面等离子共振 (SPR) 凭借其无标记、实时、高精度动力学解析的能力，确立了其在分子互作检测领域的“金标准”地位。

    在药物研发的决策链条中，SPR 数据往往是决定一个分子是进入下一阶段还是被剔除的关键依据。虽然 BLI 等新技术在通量和便捷性上提供了有力补充，但在需要最高数据质量、法规申报支持以及复杂机制解析的场景下，SPR 依然是不可撼动的首选技术。对于科研人员而言，掌握 SPR 技术不仅是获得数据的手段，更是深入理解分子识别本质的一把钥匙。