表观遗传学：DNA序列没变，基因表达却换了张脸

说真的，每次有人问我表观遗传学到底研究啥，我就喜欢打个比方：基因组是硬件，表观遗传就是操作系统。你的DNA序列一个碱基都没变，但基因表达却能被调来调去——这就是表观遗传学的核心所在。它研究的是在不改变DNA序列的前提下基因表达水平发生的变化，主要涵盖DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控这几大板块。这门学科最迷人的地方在于三个特征：可逆性意味着可以被药物干预，可遗传性意味着父母的经历能传递给下一代，环境响应性意味着你吃的东西、承受的压力甚至生活方式都能在表观遗传层面留下印记。这两年单细胞多组学和空间表观遗传学把整个领域往前推了一大截，表观遗传药物也从实验室走向了临床。下面咱们一块把这几块技术体系捋一捋。

图：表观遗传调控机制——DNA甲基化、组蛋白修饰与非编码RNA的协同调控网络

 

一、DNA甲基化检测技术体系

DNA甲基化应该是表观遗传里最老牌的研究方向了，主要发生在CpG位点上，胞嘧啶的5号碳原子被加上甲基基团变成5mC。检测这块的技术路线其实已经挺成熟了，我分几个层次来说。

最全面的是全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS），原理很直接：亚硫酸氢盐能把未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响。测序之后一比对，哪些C变成了T就知道是未甲基化的，还是C的就是甲基化的。WGBS覆盖全基因组，但成本高，对样本DNA量要求也大。如果经费有限或者只关注特定区域，可以上简化代表测序（RRBS），用限制性内切酶消化富集CpG密集区域，花小钱办大事，性价比较高。

临床上用得最多的是甲基化芯片，比如Illumina的EPIC 850K芯片，一次性检测85万个甲基化位点，通量高、重复性好，做大规模队列研究特别合适。我之前帮别人跑过一批肿瘤样本的甲基化谱，芯片出来的数据干净，差异甲基化位点一目了然，后续做功能验证也好下手。如果只是验证某个特定区域的甲基化状态，焦磷酸测序是个不错的选择，定量准确，每次能覆盖几十到一百多个碱基，适合做临床检测的验证方法。另外还有MeDIP-seq和MBD-seq，分别用抗体或甲基化结合蛋白富集甲基化DNA片段再测序，适合做全基因组甲基化区域的mapping，但单碱基分辨率不如WGBS。

还有一点值得提，5mC的氧化产物5hmC现在关注度很高，被认为有独立的生物学功能，甚至可能是去甲基化过程的中间产物。但普通的亚硫酸氢盐处理区分不了5mC和5hmC，得用oxBS-seq或者TAB-seq这类专门的技术来拆分。单细胞层面的DNA甲基化检测也起来了，scBS-seq能看每个细胞自己的甲基化状态，对研究胚胎发育和肿瘤异质性特别有用。

二、组蛋白修饰分析策略

组蛋白修饰这块说白了就是研究组蛋白尾巴上各种化学基团的添添减减，比如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等等。这些修饰像密码一样调控着基因的开关，我们组里常开玩笑说组蛋白是基因组的"调音台"。分析策略我按技术演进顺序来聊。

经典中的经典是ChIP-seq，染色质免疫共沉淀测序。原理是用甲醛把蛋白质和DNA交联固定，然后打断染色质，用针对特定组蛋白修饰的抗体把带有该修饰的DNA片段拉下来，再测序定位。比如你想看H3K4me3（跟活跃启动子相关）在全基因组的位置分布，做个ChIP-seq就完事了。但ChIP-seq有个老问题——需要的细胞量大，动辄几百万甚至上千万个细胞，做稀有样本的时候特别痛苦，而且信噪比对某些修饰不太友好。

后来CUT&RUN和CUT&Tag这两项技术的出现算是解决了痛点。CUT&RUN用MNase融合蛋白在抗体引导下原位切割目标区域附近的DNA，CUT&Tag则换成了Tn5转座酶，两者都把需要的细胞量降到了几千甚至几百个，信噪比也大幅提升。我们实验室现在做组蛋白修饰基本都转CUT&Tag了，又快又省，数据的峰型也漂亮。CUT&Tag还能直接做单细胞层面的检测，这对研究发育过程中的表观遗传异质性意义很大。

质谱在这块的应用也不容忽视。修饰特异性抗体能告诉你"在哪"，但质谱能告诉你"有多少"。定量质谱可以精确测量各种组蛋白变体和修饰的化学计量比，对于发现新的修饰类型或者理解修饰之间的cross-talk特别有用。现在越来越多人把ChIP-seq/CUT&Tag和质谱数据结合起来，一边看基因组位置分布一边看整体丰度变化，两个维度互相印证，结论会扎实很多。

三、染色质可及性研究方法

染色质可及性说白了就是基因组上哪些区域是"松开"的、可以被转录机器接触到的。紧密包装的异染色质区域基因基本是沉默的，而松散的常染色质区域才是活跃转录的主战场。研究可及性的方法有好几套，各有各的特点。

ATAC-seq现在是这个领域的绝对主力。原理简单粗暴：用工程化的Tn5转座酶去攻击细胞核里的DNA，酶只能插入到松散可及的染色质区域，切下来的片段拿去测序，峰值高的地方就是开放区域。ATAC-seq最大的优点是需要的细胞量少，500个细胞就能跑出不错的结果，而且实验流程短，从拿到细胞到上机一天就能搞定。更狠的是单细胞ATAC-seq，能看每个细胞各自的染色质开放图谱，在发育生物学和免疫细胞异质性研究里用得飞起。我们组做了一批T细胞亚群的scATAC-seq，光是看不同亚群特异性的开放峰就发现了好几个新的调控元件。

在ATAC-seq火起来之前，DNase-seq和FAIRE-seq是主力。DNase-seq用DNase I切割开放染色质，灵敏度高但实验条件苛刻，需要大量细胞。FAIRE-seq利用甲醛交联后开放区域和紧密区域在酚氯仿分配时行为不同的原理来富集开放区域，操作相对简单但信噪比一般。MNase-seq则走的是另一条路，它用微球菌核酸酶消化核小体之间的linker DNA，主要用来定位核小体占据的位置，和ATAC-seq的信息可以互补。

现在比较前沿的方向是把染色质可及性和基因表达、DNA甲基化等信息整合起来。比如用scATAC-seq和scRNA-seq的多组学技术同时测一个细胞的开放染色质和转录组，再结合空间表观遗传学技术知道这些信息在组织中的空间位置，就能构建出一张立体的基因调控地图。

四、非编码RNA调控机制

人类基因组能转录的RNA里，编码蛋白质的mRNA其实只占很小一部分，剩下大量的是非编码RNA。以前很多人觉得这些是"转录噪音"，现在没人敢这么说了，它们在表观遗传调控里扮演着举足轻重的角色。

microRNA（miRNA）是最早被研究透的一类，长度大概22个核苷酸，主要通过结合目标mRNA的3'UTR区域导致mRNA降解或者翻译抑制。一个miRNA可以调控几百个靶基因，一个基因又能被多个miRNA调控，形成了一张巨大的调控网络。检测方法上，small RNA-seq是最常用的全局筛查手段，Northern blot和qPCR用来做验证。在肿瘤研究中，某些miRNA的表达异常直接关系到癌基因的激活或抑癌基因的沉默，液态活检里循环miRNA也是热门标志物。

长链非编码RNA（lncRNA）就更复杂了，长度超过200个核苷酸，功能五花八门。有的lncRNA像支架一样把多个蛋白拉到一起形成复合物，有的像诱饵一样把miRNA或转录因子"吸走"不让它们去调控靶基因，还有的直接在转录位点附近影响RNA聚合酶的结合。Xist调控X染色体失活就是lncRNA发挥表观遗传功能的经典案例。研究lncRNA的功能机制需要一套组合拳：RNA-seq做表达谱，RIP-seq或ChIRP-seq找结合蛋白和DNA靶点，再配合敲降或敲除做功能验证。

环状RNA（circRNA）是近几年热度持续上升的一类，通过反向剪接形成闭合环状结构，稳定性特别好，不容易被外切酶降解。circRNA主要充当miRNA海绵来间接调控基因表达，也就是所谓的ceRNA机制。有些circRNA甚至能翻译蛋白，打破了非编码RNA不能编码的固有认知。这块的技术手段主要是RNase R处理富集circRNA再测序，后续验证用背对背引物做RT-PCR加上Sanger测序确认反向剪接位点。

五、表观遗传药物开发现状

表观遗传最吸引人的地方之一就是可逆性——既然修饰可以被加上也可以被去掉，那就有药物干预的空间。这块的药物开发这些年确实取得了不少突破。

最早获批的一批表观遗传药物是DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂，阿扎胞苷和地西他滨用来治疗骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病。它们的原理是掺入DNA后"困住"DNMT使其被降解，从而降低整体的DNA甲基化水平，重新激活被异常沉默的抑癌基因。这类药物已经上市十几年了，虽然有效但选择性不够好，副作用也不小，新一代的DNMT抑制剂正在努力改善这些问题。

组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂是另一大类，伏立诺他和罗米地辛已经获批用于皮肤T细胞淋巴瘤等。乙酰化一般跟基因激活相关，HDAC把乙酰基去掉就相当于关掉了基因，抑制剂的作用就是让基因保持开放状态。但HDAC家族成员众多，现有的抑制剂大多广谱，特异性有限，选择性HDAC亚型抑制剂是当前的开发热点。

近年来靶向更精确的表观遗传药物开始冒头。EZH2抑制剂他泽司他获批用于上皮样肉瘤，靶向的是组蛋白甲基转移酶EZH2，在特定突变类型的淋巴瘤中也显示出了疗效。BET抑制剂targeting BRD4等溴结构域蛋白，能把"读码器"从组蛋白乙酰化标记上抢走，在血液肿瘤中效果不错，不过实体瘤的试验结果不太理想。还有针对IDH1/2突变的抑制剂，间接影响DNA和组蛋白的甲基化状态，也算半个表观遗传药物。

我个人的感受是，单药的效果往往有限，表观遗传药物最大的潜力可能在于联合治疗——跟免疫检查点抑制剂联用解除肿瘤的免疫抑制微环境，或者跟化疗联用逆转耐药。临床上已经有不少这样的组合试验在推进，值得持续关注。

表观遗传学这门学科从最初的"边缘话题"已经成长为生命科学的核心领域之一。技术层面，从WGBS到CUT&Tag再到scATAC-seq，检测手段越来越灵敏、越来越精细；应用层面，从基础机制研究到临床药物开发，表观遗传的影子无处不在。未来的看点在于单细胞多组学的整合分析以及空间表观遗传学的发展——我们终于有能力在单个细胞、甚至保留空间位置信息的条件下去理解表观遗传调控的全貌。这个领域的精彩，才刚刚开始。