RNA pulldown实验技术详解，从探针设计到蛋白鉴定的全流程指南

分子生物学 · 实验技术专栏

RNA pulldown说白了就是一场"钓鱼实验"——你拿一段RNA当饵料，把跟它结合的蛋白从细胞裂解液里"钓"出来。这个技术在研究非编码RNA功能、mRNA稳定性调控、可变剪接这些方向用得特别多。踩过坑的都知道，这实验看着原理简单，但细节里全是魔鬼。今天就把整个流程从头到尾捋一遍，把我这些年踩的坑也一并告诉你。

 

一、生物素标记RNA探针：设计你的"鱼饵"

做RNA pulldown，第一步肯定是设计探针。你得根据目标RNA的序列，设计一段生物素标记RNA探针。这玩意儿就是你钓鱼的饵料，好不好用直接决定你最后能钓到什么。

探针设计有几个讲究。首先是长度，一般200-500nt比较合适，太短了结合力不够容易掉，太长了容易形成二级结构反而影响特异性。其次要选目标RNA上比较"暴露"的区域，也就是预测二级结构里不太会折叠起来的区段，这样蛋白才更容易接触到。如果你研究的RNA特别长，建议多设计几段探针分开做，别指望一段探针搞定一切。

还有个关键点——生物素怎么标记上去。有两种方式：一种是在探针的末端直接加生物素（末端标记），另一种是转录的时候掺入生物素-UTP（内部标记）。我个人更推荐内部标记，因为标记密度高，后面抓磁珠的时候更牢固。别嫌麻烦选了末端标记结果信号弱，到时候哭都来不及。

 

二、体外转录制备探针：把探针造出来

设计好序列之后，怎么把探针实际造出来呢？最常用的方法就是体外转录制备探针。说白了就是把你的目标序列克隆到一个带有T7或SP6启动子的载体上，然后用对应的RNA聚合酶在体外把RNA转录出来。

具体操作是先把模板DNA线性化，然后配转录体系：模板DNA、NTP混合物（其中UTP要用生物素-UTP替换一部分）、RNA聚合酶、RNase抑制剂，放在37度反应1-2小时。转录完之后用DNase I把模板DNA消化掉，再用乙醇沉淀或者柱子纯化RNA探针。

这一步有几个坑要注意。第一，RNase无处不在，你的枪头、离心管、手套都可能沾上RNase，所有耗材都要用DEPC处理过的或者RNase-free的，操作的时候口罩手套戴好，别用手碰管口。第二，生物素-UTP和普通UTP的比例要优化，一般1:2到1:4比较合适，掺太多反而影响转录效率。第三，转录完一定要跑个胶看看探针质量，条带单一、大小正确才能往下做，别拿一堆降解的RNA去浪费时间。

 

三、链霉亲和素磁珠：你的"钓鱼竿"

有了带生物素的RNA探针，接下来需要一样东西把它"抓住"——这就是链霉亲和素磁珠。链霉亲和素（streptavidin）和生物素（biotin）之间的结合是自然界中最强的非共价相互作用之一，解离常数Kd大约是10的负15次方摩尔每升，基本上结合上了就不会掉。

图1：生物素-链霉亲和素高亲和力结合机制示意图。生物素标记的RNA探针通过这种"分子拉链"被牢牢固定在磁珠表面。

 

磁珠的用法也简单。先用洗涤缓冲液洗两遍磁珠，去掉保存液里的防腐剂，然后把你的生物素标记RNA探针加进去，室温旋转孵育30分钟到1小时，探针就挂在磁珠上了。孵育完用磁力架把磁珠吸住，吸掉上清，洗几遍就把没挂上去的探针洗掉。

这里有个经验之谈：磁珠的用量要根据探针量来算，一般每微克RNA探针用50-100微升磁珠悬液（取决于厂家的binding capacity）。磁珠太少探针挂不完浪费材料，磁珠太多非特异性结合会增加背景。买磁珠的时候看好说明书上的binding capacity，别稀里糊涂就开干。

 

四、RNA结合蛋白(RBP)：你到底在钓什么

说了半天技术，咱们回到根本问题：你到底在钓什么？答案就是RNA结合蛋白(RBP)。这类蛋白在细胞里数量庞大，已知的就有上千种，它们跟RNA结合后调控RNA的方方面面——剪接、转运、翻译、降解，全归它们管。

比较经典的有HuR（也叫ELAVL1），它喜欢结合AU-rich元件（ARE），跟mRNA稳定性密切相关；还有hnRNP家族的一大票蛋白（hnRNP A1、hnRNP K等等），它们参与剪接调控；另外像FUS、TDP-43这些蛋白，在神经退行性疾病研究中也是常客。

做实验之前你得想清楚：我是验证某个已知蛋白跟我的RNA有没有互作？还是想无偏向地找新的结合蛋白？目标不同，后面走的路也不一样。前者主要靠Western blot验证就行，后者就得做质谱了。先想清楚再动手，免得做了一半发现方向不对。

图2：RNA结合蛋白与靶RNA形成的相互作用网络。一条RNA可能同时被多个RBP调控，一个RBP也可能结合多条RNA，形成复杂的调控网络。

 

五、细胞裂解与蛋白提取：准备"鱼塘"

有了探针和磁珠，接下来要准备"鱼塘"——也就是细胞裂解液。这一步叫细胞裂解与蛋白提取，看似简单，但做好了能让你后面的实验事半功倍。

一般用RIP lysis buffer来裂解细胞，配方大致是50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM KCl、1 mM EDTA、0.5% NP-40或Triton X-100，再加蛋白酶抑制剂和RNase抑制剂。这个配方的核心思路是在裂解细胞的同时尽量保持RNA-蛋白复合物的完整性——NP-40这种温和的去垢剂能把细胞膜打开，但不会把RNA-蛋白复合物拆散。

图3：RNA pulldown完整实验流程。从细胞裂解、探针孵育、磁珠富集到洗脱检测，每一步都需要严格控制条件以保持复合物完整性。

 

裂解的时候冰上操作，吹打均匀后冰上放置15-30分钟，中间隔几分钟轻轻混匀一下。然后4度离心10分钟去掉不溶性碎片，上清就是你的裂解液了。蛋白浓度测一下（BCA或Bradford都行），一般用500微克到2毫克总蛋白做一次pulldown。

这里要特别强调：全程冰上操作！RNase抑制剂一定要加足量！有些师兄图省事室温裂解，结果RNA降解了，钓出来的全是非特异性的垃圾，后面怎么解释都解释不通。这一步偷懒后面哭都来不及。

 

六、亲和富集原理：鱼是怎么上钩的

前面铺垫了那么多，现在终于到了核心环节——"钓鱼"本身。这一步的原理就是亲和富集原理，利用生物素和链霉亲和素之间的高亲和力，把RNA-蛋白复合物固定在磁珠上。

操作流程是这样的：先把挂好探针的磁珠跟细胞裂解液混合，4度旋转孵育2-4小时（过夜也行，但别太长，怕非特异性结合增加）。孵育过程中，裂解液里跟探针RNA特异性结合的RBP就会"咬钩"，通过RNA探针-生物素-链霉亲和素-磁珠这条链路被固定在磁珠上。

孵育完之后就是洗涤了。这一步特别关键，洗得不干净背景高，洗得太狠把特异性的也洗掉了。一般用含有逐渐降低盐浓度的洗涤缓冲液洗3-5遍，最后一遍可以用高盐（比如300-500 mM KCl）洗掉弱结合的非特异性蛋白。如果你发现背景太脏，可以试试在洗涤缓冲液里加点去垢剂或者增加洗涤次数，具体条件得自己摸索。

洗完之后就是洗脱了。用SDS上样缓冲液加热变性洗脱，或者用游离的生物素竞争洗脱，看你后面要做什么。如果跑胶做质谱，直接用SDS buffer煮10分钟最省事。

 

七、SDS-PAGE凝胶电泳：看看钓到了什么？

洗脱下来的蛋白是一锅混合物，你得想办法把它们分开看看。这时候就该SDS-PAGE凝胶电泳出场了。SDS给蛋白加上均匀的负电荷，PAGE凝胶按分子量大小把它们分离开，跑完之后考马斯亮蓝染色，你就能看到一条条蛋白条带。

正常情况下，实验组（sense探针）比对照组（antisense探针）多出来的条带就是你的候选蛋白。如果两组长得一模一样，那要么是没钓到特异性蛋白，要么是洗涤条件太松了背景太高。这时候别灰心，调一调盐浓度和洗涤次数再试一次。

图4：SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果（左）与Western blot验证结果（右）。实验组出现的特异性条带经切胶送质谱鉴定，Western blot可对已知候选蛋白进行快速验证。

 

跑胶的时候注意几个细节：胶浓度一般用10%或12%，分子量范围大的话可以用梯度胶；上样量别太多，不然条带糊成一坨看不清；marker要选覆盖范围合适的，方便后面判断条带大小。跑完染色之后拍照存档，特异性的条带用干净的刀片切下来，装EP管里准备送质谱。切胶的时候戴手套，刀片用一次换一次或者火焰灼烧，别引入角蛋白污染——质谱里满屏的角蛋白峰是很丢人的事情。

 

八、Western blot验证：确认你的目标

如果你心里已经怀疑某个蛋白会跟你的RNA结合，那就直接上Western blot验证，不用等质谱结果出来再慢慢找。这个思路就是"假设驱动"——文献报道或者你之前的线索提示某个RBP可能是互作蛋白，那就直接用抗体去验证。

操作上跟普通Western blot差不多：把pulldown洗脱下来的蛋白跑SDS-PAGE，转膜之后用目标蛋白的特异性抗体去孵育，最后显影看信号。关键是你的对照要设好：实验组（sense探针）有信号，对照组（antisense探针或者无探针）没有或者弱很多，那这个互作就比较靠谱了。

但这里有个陷阱要注意——Western blot灵敏度高，有时候实验组和对照组都有信号，只是实验组强一点。这种情况下不能轻易下结论说有特异性互作，最好做定量分析（比如灰度值比较），并且重复至少三次看一致性。另外，input也要跑，确认你的裂解液里确实有这个蛋白，不然万一裂解液里根本没有，你怎么钓也钓不到。

 

九、质谱鉴定(LC-MS/MS)：发现未知蛋白

但很多时候你是"盲钓"——根本不知道会钓到什么。这时候就得靠质谱鉴定(LC-MS/MS)来给你答案了。质谱的原理说复杂也复杂，说简单也简单：把蛋白切成小肽段，用液相色谱分离后进入质谱仪，根据质荷比和碎片信息来反推肽段序列，再跟数据库比对就知道是什么蛋白了。

具体流程是：把SDS-PAGE胶上的特异性条带切下来，用胰蛋白酶（trypsin）进行胶内酶切，酶切产生的肽段提取出来上LC-MS/MS分析。数据拿到手之后用MaxQuant或者Proteome Discoverer这类软件搜库，就能得到一串蛋白列表。

质谱结果的分析是个技术活。首先你要排除常见的污染蛋白，比如角蛋白、keratin这些。然后看实验组比对照组多出来的蛋白，这些才是你的候选。最好看那些有多个unique peptide、序列覆盖度高的蛋白，这些结果更可靠。拿到候选名单之后，还得回过头去用Western blot或者RIP实验反向验证，质谱给的是线索，不是最终结论。别拿到一个列表就兴奋地写文章，验证这一步省不了。

 

十、反义链对照：别被假阳性骗了

最后说一个特别重要的环节——对照。做RNA pulldown，反义链对照是不可或缺的。所谓反义链对照，就是用你目标RNA的反义链（antisense RNA）作为探针，走一遍完全相同的流程。

反义链的碱基序列跟正义链互补，理论上不会跟同样的蛋白结合（除非有些蛋白专门识别双链RNA，这种另说）。所以如果你的目标蛋白在正义链探针组出现了，而在反义链对照组没有，那这个互作就比较有说服力。反过来说，如果两组都有，那大概率是非特异性结合，不能当真。

除了反义链对照，还有几种对照也值得考虑。一个是无探针对照（只加磁珠和裂解液），用来评估磁珠本身吸附的非特异性蛋白；一个是突变探针对照，在结合位点上引入点突变，看互作是否消失。这些对照不是每次都要全做，但至少反义链对照必须要有，这是底线。投文章的时候审稿人第一个问的就是你的对照怎么设的，如果你只有一个实验组没有对照组，人家直接就给你拒了，连解释的机会都没有。

另外提一句，RNA pulldown和RIP（RNA immunoprecipitation）是互为反向验证的好搭档。RNA pulldown是用RNA钓蛋白，RIP是用抗体钓蛋白再看上面有没有你的RNA。两个实验互相印证，你的结论就站得住脚了。做科研嘛，一条证据链不够，交叉验证才是王道。

RNA pulldown这个实验，说到底就是"设计探针→挂磁珠→裂解细胞→孵育富集→洗涤洗脱→跑胶验证"这么一条线。每一步都有坑，但只要注意RNase防护、控制好洗涤条件、设好对照，基本上能拿到比较可靠的结果。新手刚上手的时候别急，先摸清楚条件再大规模做，毕竟探针和细胞都不便宜，做废一次心疼半天。希望这篇指南能帮你少走点弯路，祝实验顺利！