凝胶电泳迁移实验EMSA：蛋白-DNA相互作用验证的实操指南

分子生物学系列：从标记探针到超迁移Super-shift，蛋白-DNA相互作用验证的实验室实战手册

说句实在话，做转录调控的同学应该都绕不开EMSA这个实验。EMSA全称Electrophoretic Mobility Shift Assay，中文叫凝胶电泳迁移实验，也叫凝胶阻滞实验或者凝胶迁移率实验。说白了就是看蛋白跟DNA（或者RNA）到底结不结合——转录因子这类DNA结合蛋白能不能认出特定的DNA序列并抓上去，这是研究基因表达调控的核心问题之一。

这技术是上世纪80年代发展起来的，最早的版本用放射性同位素标记探针，到现在四十多年了还在全世界实验室天天用，说明它是真好使。它跟ChIP、双荧光素酶报告基因这些是搭配着用的——ChIP告诉你体内谁跟DNA结合，EMSA则是在体外直接验证这种结合，两者一内一外互相印证。
 

原理说白了就是"跑得慢"

EMSA的原理其实特别简单。游离的DNA探针分子量小，在非变性聚丙烯酰胺凝胶（Native-PAGE）里跑得快；一旦蛋白结合上去形成蛋白-DNA复合物，分子量一下大了不少，迁移率就慢下来了，在胶里就会"滞后"，这就是所谓的"凝胶阻滞"（gel shift）。把探针标记上（生物素、荧光或者同位素），电泳完转膜显影，你就能看到一条带的位置变了——这就能证明有蛋白跟你的探针结合了。

这里要强调一句，EMSA用的是非变性凝胶，千万别加SDS，加了蛋白就变性了，结合也就散了。而且整个结合反应和电泳都得在低温（一般4℃）下做，不然那些不太稳定的复合物容易解离，跑着跑着就分开了，那肯定看不到带。

图1：EMSA基本原理。游离探针跑得快（最下），蛋白-探针复合物滞后（中），加抗体形成三聚体后超迁移到最上方。

 

探针怎么标记，设计有讲究

探针是EMSA的灵魂，标记方式直接决定灵敏度和操作便利性。老牌的是γ-32P放射性同位素末端标记，灵敏度最高，但得有同位素资质、得做防护，现在很多实验室不愿意折腾了。现在最主流的是生物素（Biotin）标记，配合链霉亲和素-HRP和化学发光（ECL）检测，灵敏度和32P接近，还没有放射性的麻烦，是大多数实验室的首选。另外还有地高辛（DIG）标记和荧光标记可选。

探针设计这块坑不少。长度一般控制在20-50 bp，太长了容易出现多个结合位点，结果没法分析。设计完一定要用OligoAnalyzer这类工具查一下二级结构，别让探针自己折叠成发卡或者错配二聚体。AT/GC比例也要看，GC含量太高退火都困难。还有一点——突变探针（用来做冷竞争对照的）一定要把结合位点那几个关键碱基突掉，否则起不到对照作用。

实操小贴士

探针退火别马虎。两条互补单链等摩尔混合，95℃加热5分钟，然后关掉热块让它慢慢冷到室温，急冷容易退火不完全。退火好的双链探针分装保存在-20℃，别反复冻融。常用的NF-κB共识探针序列是5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'，拿来当阳性对照练手很合适[4]。

 

蛋白样品和结合反应的讲究

蛋白样品可以用纯化蛋白、部分纯化蛋白，或者直接用细胞核抽提液（nuclear extract）。纯化蛋白背景干净好分析，但很多蛋白体外纯化后活性不行；核抽提液更接近生理状态，但里面杂蛋白多，背景容易上来。核抽提液得保存在-80℃，千万别反复冻融，活性掉一半以上基本就得扔了[4]。

结合反应体系里有几个关键成分。第一是结合缓冲液，典型配方是10 mM HEPES（pH 7.9）、50 mM KCl、1 mM DTT、5%甘油，有的还加0.1% NP-40——DTT保持蛋白还原状态，甘油稳定蛋白构象[4]。第二，也是最容易踩坑的——poly(dI-dC)。这是个非特异性竞争DNA，作用是把核抽提液里那些"见DNA就抓"的非特异性核酸结合蛋白先喂饱，让它们别去抢你的标记探针。用量得预实验摸索，一般0.05 mg/ml左右，核抽提液大概每2-3 μg蛋白配1 μg poly(dI-dC)[3]。用纯化蛋白的时候可以不加或者少加。

避坑指南

poly(dI-dC)加多了会把你的特异性结合也给竞争掉，加少了背景糊一片。这个没有万能配方，必须针对自己的蛋白和探针做个梯度预实验。另外蛋白和探针都要避免反复冻融，分装是王道。电泳前一定先预电泳30分钟，把胶里的杂质跑掉再上样，不然背景能让你怀疑人生。

 

冷竞争和Super-shift：怎么证明结合是特异的

光看到一条shifted带还不够——你怎么知道这是你的目的蛋白特异性结合，还是某个杂蛋白瞎抓上去的？这就得靠两个关键对照：冷竞争和超迁移（Super-shift）。

冷竞争（cold competition）就是往反应里加100倍过量的未标记同源探针（俗称"冷探针"）。如果结合是特异的，冷探针会把蛋白抢走，标记探针的shifted带就消失了或者明显减弱。反过来，你再加100倍过量的突变探针（结合位点突掉的那种），shifted带应该还在——这就说明蛋白认的是那段特异序列，不是随便抓[1]。

Super-shift更进一步。往反应里加针对目的蛋白的特异性抗体，抗体结合到蛋白-DNA复合物上形成三聚体，分子量更大、迁移更慢，于是在shifted带的上方又多出一条——这就是"超迁移"带[1]。加了抗体出现super-shift，基本就能板上钉钉地说"跟探针结合的就是我这个蛋白"。

但这里有个坑——不是所有抗体都能做super-shift。只有那些识别天然构象（非变性）蛋白表面表位的抗体才行，识别线性表位的抗体往往做不出来。一般10-20 μL反应液加0.5-1 μL原倍抗体。有时候抗体太猛，跟复合物形成大聚集物根本不进胶，这时候虽然看不到super-shift带，但shifted带会明显减少，这也算一种阳性信号[3]。

标准EMSA结果图：五条道怎么看标记探针+蛋白+冷WT探针✗阻滞消失+冷突变探针✓阻滞保留+特异抗体Super-shift游离探针阻滞带超迁移迁移方向冷WT竞争使阻滞消失、冷突变竞争保留、抗体引起超迁移 = 特异性结合

图2：标准五道EMSA结果解读。Lane3冷野生型竞争掉阻滞、Lane4冷突变型保留、Lane5抗体引起超迁移，三者共同证明结合的特异性。

 

结果图怎么看，常见坑

一张标准的EMSA结果图通常五条道（lane）[1]：Lane 1只有标记探针，一条带在最下面；Lane 2蛋白+标记探针，上面多出一条shifted带；Lane 3再加100倍冷野生型探针，shifted带消失；Lane 4再加100倍冷突变探针，shifted带还在；Lane 5加特异性抗体，shifted带上方出现super-shift带。

实际操作中常遇到的问题：看不到shifted带，多半是蛋白降解了、量不够、探针被降解、或者曝光太短，也可能是这个蛋白跟你这段探针压根不结合；条带模糊拖尾，往往是非特异性结合太重，得多加点poly(dI-dC)或者检查探针纯度；出现好几条shifted带，可能是蛋白形成多聚体、或者核抽提液里有好几种结合蛋白，这时候super-shift能帮你定位到底哪条是你想要的[2]。

另外提一句，做RNA EMSA（研究RNA结合蛋白）比DNA版难不少，全程得RNase-free，枪头、试管都用DEPC处理过的水配，稍微沾点RNase污染探针就降解了，新手不推荐一上来就碰RNA的[1]。还有一点容易被忽略——EMSA本质是半定量的，shifted带的强弱能粗略反映结合量，但真要比较不同样品之间的结合差异，得用ImageJ这类软件做灰度分析，跨批次比较还得先做内参校正，别光凭眼睛看深浅就下结论。

实操小贴士

6%的非变性胶（丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1）配0.5×TBE是常规选择，探针短就稍微提高胶浓度。4℃下100 V跑1.5-2小时，溴酚蓝跑到胶底端就停。转膜用尼龙膜（0.45 μm），380 mA恒流30分钟，UV交联120 mJ/cm²固定。曝光时先短曝光看个大概，再调时间，别一上来就压太久把背景压起来了[4]。

 

实操经验

EMSA的优势在于它直接测的是蛋白的DNA结合活性——免疫组化和Western只能告诉你蛋白表达没表达、在哪儿，但表达出来不等于能结合DNA，这点EMSA是无可替代的[3]。但它也有局限：看不出复合物里蛋白的分子量，也模拟不了体内染色质那种复杂环境，电泳过程中复合物要是快速解离，可能明明能结合却检测不到[1]。所以现在做转录调控，基本都是EMSA + ChIP + 双荧光素酶报告基因三件套一起上，互相印证才靠谱[2]。

温度控制全程别松懈，从配胶预电泳到跑胶都在4℃冷库里做，缓冲液提前预冷。每批实验一定带阴性对照（BSA代替蛋白）和阳性对照，没有对照的EMSA结果基本不可信。新手建议先用NF-κB共识探针配商业核抽提物跑通流程，再上自己的样品，能少走不少弯路。