为了排除假阳性结果,需要设置哪些对照实验,对照实验的酵母细胞应如何构建和处理?
为排除 RIP-qPCR 实验的假阳性结果,通常需设置多种对照实验,以下是一些常见对照实验及其酵母细胞的构建和处理方法:
一、阴性对照
1、抗体阴性对照
构建:选用与实验目的蛋白无关的非特异性抗体,如正常小鼠 IgG 或兔 IgG 等,其应不与酵母细胞内的任何蛋白发生特异性结合。
处理:在酵母细胞裂解后,将非特异性抗体加入到细胞裂解液中,后续处理步骤与使用特异性抗体的实验组完全相同,包括免疫沉淀、洗涤、RNA 提取及 qPCR 分析等过程。
2、无抗体对照
构建:不使用任何抗体,直接进行后续实验操作。
处理:对酵母细胞进行裂解等操作后,直接加入磁珠进行孵育,后续同样进行免疫沉淀、洗涤、RNA 提取及 qPCR 等步骤,以检测是否存在非特异性的 RNA 与磁珠或其他实验成分结合的情况。
二、阳性对照
1、已知相互作用对照
构建:选择已知在酵母细胞中能与特定 RNA 结合的蛋白及对应的 RNA 作为阳性对照体系。例如,若研究 mRNA 的加工过程,可选用已知的参与 mRNA 剪接的蛋白及其作用的 mRNA 作为阳性对照。
处理:将表达已知相互作用蛋白的基因通过质粒转化等方法导入酵母细胞,使其在酵母细胞中正常表达。然后按照与实验组相同的实验流程进行操作,包括细胞裂解、免疫沉淀、RNA 提取和 qPCR 分析等,以验证实验体系的有效性。
2、内源性阳性对照
构建:利用酵母细胞内源性的、稳定表达且已知有明确 RNA 结合功能的蛋白及相应 RNA 作为阳性对照。比如酵母细胞中的某些核糖体蛋白与 rRNA 的结合是已知且稳定存在的,可以选择此类蛋白和 rRNA 作为内源性阳性对照。
处理:无需额外导入基因,直接使用正常培养的酵母细胞,按照实验流程进行操作,观察阳性对照的结果是否符合预期,以此判断实验体系是否正常工作。
三、背景对照
1、Input 对照
构建:取一部分未经免疫沉淀的酵母细胞裂解液作为 Input 对照,它包含了细胞内所有的 RNA 和蛋白等成分,代表了细胞内 RNA 的总体水平。
处理:将酵母细胞裂解后,取适量裂解液保存,其余裂解液用于免疫沉淀实验。对保存的 Input 裂解液进行与免疫沉淀后样品相同的 RNA 提取和 qPCR 分析步骤,以便与免疫沉淀后的样品进行对比,了解免疫沉淀的效率和特异性。
2、Mock 对照
构建:对酵母细胞进行与实验组相同的培养和处理,但不进行免疫沉淀步骤,直接进行 RNA 提取等后续操作。
处理:将酵母细胞培养至合适的生长阶段,然后进行细胞裂解等操作,但不加入抗体和磁珠进行免疫沉淀,而是直接从裂解液中提取 RNA,再进行 qPCR 分析,用于检测在没有免疫沉淀过程时,是否存在非特异性的 RNA 富集或干扰因素。
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