BIFC蛋白互作实验步骤和技术详解！

    双分子荧光互补(BimolecularFluorescent Complimentary, BiFC)技术是指通过具有相互作用亲和力的两个蛋白质，将分别与其相连的荧光蛋白片段拉近，组装成完整的荧光蛋白，从而表征蛋白质相互作用的发生及其空间位置。

    当蛋白质A与蛋白质B在细胞内发生相互作用时，它们各自的荧光蛋白片段也会随之靠近，形成完整的荧光蛋白构象。这种构象恢复使得荧光蛋白能够发出特征荧光，从而在显微镜下可视化地反映出蛋白质A与B的相互作用。

双分子荧光互补验证蛋白互作的原理图

BIFC实验流程

    ● 构建融合蛋白：设计并合成针对目标蛋白A和B的特异性引物，将其分别与荧光蛋白N端和C端片段基因融合，构建相应的表达载体。

    ● 细胞转染：将含有融合蛋白A-N端和B-C端片段的载体同时或分别转入感兴趣的细胞系，实现融合蛋白的共表达。

    ● 荧光观察：转染后一段时间（通常24-48小时），使用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察细胞，若观察到绿色（或对应荧光蛋白颜色）荧光信号，说明蛋白质A和B发生了相互作用。

BIFC技术优势

    ● 活细胞内检测：能够在细胞生理状态下直接观察蛋白质相互作用，保留了时空动态信息。

    ● 高特异性：只有当目标蛋白相互作用时，荧光信号才会出现，减少了假阳性结果，提高了检测的特异性。

    ● 多色标记：通过使用不同颜色的荧光蛋白对，可同时检测多个蛋白质相互作用，实现多维度、多层次的蛋白质互作网络研究。

    ● 直观且定量：通过荧光强度衡量互作程度，可以通过荧光强度定量分析软件进行半定量或定量评估，为研究蛋白质互作的动态变化和强度提供直观且量化的数据。

    ● 适用于多种生物体系：广泛适用于动物、植物、微生物等生物体系，在植物研究中，尤其适用于研究蛋白质在特定细胞器、细胞结构或特定生理条件下的互作。

    ● 检测弱或瞬时相互作用：对低亲和力、短暂相互作用敏感，能够揭示一些传统方法难以检测到的相互作用。

BIFC技术应用

    ● 蛋白质互作网络研究：揭示复杂信号通路中蛋白质间的直接相互作用。

    ● 细胞内定位与动态研究：观察蛋白质相互作用在细胞内的空间分布及其随时间的变化。

    ● 药物筛选与验证：检测候选药物对特定蛋白质相互作用的影响，评估其生物活性。

    ● 植物科学：研究植物生长发育、逆境响应、信号传递等过程中的关键蛋白质互作。

    ● 神经科学：揭示神经元间或神经元内部蛋白质的相互作用，如突触形成、神经递质释放、离子通道调控等。

    ● 癌症研究：研究致癌基因与抑癌基因、癌蛋白与微环境因素的相互作用，揭示癌症发生发展的分子机制，为诊断、预后评估和个性化治疗提供依据。

BIFC实验优化与注意事项

    ● 融合片段选择：选择对荧光蛋白功能影响较小的片段融合位点，确保片段重组后荧光蛋白功能恢复。

    ● 荧光蛋白选择：考虑荧光蛋白的亮度、稳定性、光谱特性等因素，选择最适合实验条件的荧光蛋白。

    ● 对照设置：包括阴性对照（表达单个荧光蛋白片段的细胞）和阳性对照（已知存在相互作用的蛋白质对）。

    ● 转染效率与表达水平监控：确保细胞转染效率足够高，且融合蛋白表达水平适中，避免过表达干扰。

BIFC实验设计与结果解读

载体构建

    如上图所示，BiFC系统包含两个质粒，一个质粒上带有到YFP蛋白的N端173个氨基酸，另一个质粒上带有YFP蛋白C端155个氨基酸。将待测蛋白A和B分别构建到两个载体上，与YFP的N部分和C部分分别融合表达，如果A和B蛋白能够结合，则YFP的两个部分也能重新组合在一起发出荧光。载体上分别带有Myc标签和HA标签，供WB验证。

结果解读

转染烟草后拍照检测

    ● 默认分组方式如上图所示，每组每个视野都会拍摄荧光、明场以及融合3张照片；

    ● “YN173-P1 + YC155-P2”为阳性对照，“P1”和“P2”是已知能够互作的蛋白；

    ● “YN173 + YC155”为阴性对照，转染的一对空载质粒，不会检测到荧光；

    ● “YN173-A + YC155-B”为实验组，“A”和“B”指代待验证是否互作的一对蛋白，在阴阳性对照正常的情况下，如果实验组能检测到荧光，说明两个蛋白能够互作，反之说明两个蛋白不能互作；

    ● “YN173-A + YC155”和“YN173 + YC155-B”为单分子对照组，同阴性对照不会检测到荧光。

    ● 由于融合表达蛋白空间构象的问题，有时在没有检测到互作的情况下，调换两个蛋白的BiFC载体重新验证，又能够检测到互作。