细胞运动性检测实战指南：划痕实验与Transwell迁移侵袭全流程解析

师兄师姐踩坑笔记 · 新手避雷必读  细胞生物学 | 实验技术实战：细胞运动性检测实战指南，划痕实验与Transwell迁移侵袭全流程解析。

做肿瘤转移研究的同学，细胞迁移侵袭实验那是跑不掉的基本功。今天咱们就把最常用的两套方案——划痕实验和Transwell，从头到尾捋一遍。这篇文章不讲那些花里胡哨的理论，就讲实操，讲踩坑，讲怎么把数据做漂亮。新来的师弟师妹们搬好小板凳，咱们开讲。

划痕实验，也叫wound healing assay，是最经典的体外检测细胞迁移能力的方法。操作简单、成本低，但坑也不少，下面一步步来。

 

1、细胞划痕实验原理

说白了就是在细胞上划一刀。先把细胞养到长满培养皿底，形成一层融合的单层细胞（confluent monolayer），然后用枪头在中间人为制造一个空白区——也就是"伤口"。接下来把细胞放回培养箱，观察边缘的细胞会不会往中间这片空地爬。细胞划痕实验原理的本质，就是模拟体外的伤口愈合过程：细胞失去了接触抑制，开始向空白区域迁移，一段时间后伤口逐渐被"填上"。我们通过测量伤口面积随时间的变化，就能量化细胞的迁移能力。

这个实验看着简单，但原理上有两个关键点你得搞明白。第一，划痕实验测的是"集体迁移"（collective migration），是整片细胞一起往里挪，不是单个细胞乱跑，所以它更接近伤口愈合、上皮修复这类生理过程。第二，细胞"填满"伤口其实有两股力量在起作用：一是真的迁移过去的，二是细胞自己分裂增殖"撑"过来的。这俩搅在一起，你的数据就不纯了。所以后面我们会专门讲怎么把增殖这个干扰因素摁住。

图1. 细胞划痕实验示意图：在融合单层细胞上制造伤口，观察细胞向中央迁移愈合的过程

 

2、伤口愈合率计算

做完了实验，数据怎么算？这里有个标准公式，必须记牢：伤口愈合率计算的公式是 愈合率(%) = (A₀ − Aₜ) / A₀ × 100%。其中 A₀ 是0小时的初始伤口面积，Aₜ 是t时刻的伤口面积。举个例子，0小时你量出来伤口是50000平方微米，24小时后变成20000平方微米，那愈合率就是 (50000 − 20000) / 50000 × 100% = 60%。这个数字越大，说明细胞爬得越快、迁移能力越强。

踩过坑的都知道，算这个愈合率最容易出问题的是面积测量的准确性。同一个伤口，你框得松一点紧一点，面积能差出好几千。所以一定要固定好测量方法，0小时和各时间点用同一套标准来框。另外别忘了设对照组——比如正常细胞和敲低某个基因的细胞一起做，对比愈合率才有意义。还有一点，愈合率不是越高越好，如果24小时伤口几乎全愈合了，说明细胞爬太快，你中间的时间点可能就漏掉了关键变化，下次可以把时间点加密，或者换迁移慢一点的细胞系。

 

3、ImageJ面积分析

面积怎么量？手动数格子肯定不行，这时候就轮到ImageJ上场了。ImageJ面积分析是划痕实验数据处理的标配操作。具体步骤是这样的：打开ImageJ，把照片拖进去，用多边形工具（Polygon Selection）沿着伤口边缘一圈一圈地把伤口区域圈出来——注意要沿着细胞前沿走，圈得太靠里太靠外都不准。圈好之后，点菜单栏 Analyze → Measure，弹出来的窗口里有个"Area"值，这就是伤口面积，单位是像素或者你标尺校准后的实际面积（平方微米）。

这里有几个细节别嫌麻烦一定要做。第一，先用标尺照片校准ImageJ的scale，不然你量出来的是像素不是真实面积，没法比较不同实验批次。Set Scale这一步千万别跳过。第二，圈伤口的时候建议把图片放大，用放大镜工具看得清边缘，手抖的话可以多圈几次取个平均。第三，如果伤口边缘不整齐、形状复杂，多边形工具比矩形准多了，别图省事用矩形框。第四，同一批照片建议用同一套阈值和分析参数，保证可比性。ImageJ虽然界面土了点，但它是免费的、功能强大的，熟练了比什么商业软件都顺手。

注意事项：ImageJ校准标尺一定每个物镜倍数单独做一套，4倍、10倍、20倍的像素/微米换算系数不一样，混用就全乱套了。拍照的时候记得拍一张带标尺的照片用来校准。

 

4、低血清培养基抑制增殖

前面原理部分说过，细胞"填"伤口有迁移和增殖两股力量。怎么把增殖摁住？最常规的做法就是换低血清培养基。低血清培养基抑制增殖的原理很简单：血清里有大量生长因子，刺激细胞分裂增殖，把血清浓度降下来，细胞基本就不怎么分裂了，那剩下的伤口愈合就主要靠迁移。

具体怎么操作？正常培养用10% FBS的培养基，做划痕实验的时候换成0.5%到2% FBS的低血清培养基。我个人经验，2%是比较稳妥的浓度——既能保住细胞活性不让它们饿死，又能把增殖压到很低。如果做到0.5%，有些娇气的细胞系（比如某些原代细胞）可能扛不住，24小时就状态不行了。换低血清的时机也有讲究：一般是划痕完了、PBS洗掉脱落的细胞之后，立刻换成低血清培养基，然后才开始拍0小时的照片。这样从一开始增殖就被摁住了。

不过说实话，低血清只能减少增殖，没法100%消除。血清里哪怕只剩0.5%，还是有一点点生长因子。如果你的实验对增殖干扰特别敏感，光靠低血清不够，那就得上下面这个大招了。

 

5、丝裂霉素C预处理

想要彻底排除增殖干扰，丝裂霉素C了解一下。丝裂霉素C预处理是划痕实验里专门用来"冻结"细胞增殖的杀手锏。丝裂霉素C是一种DNA交联剂，能跟DNA形成共价键，让DNA没法复制，细胞就卡在细胞周期里动不了——分裂这条路彻底堵死。这样你测到的伤口愈合，就是纯纯的迁移，一点增殖的水分都没有。

具体用法：在划痕之前，用含丝裂霉素C的培养基处理细胞1小时左右，浓度一般用10 μg/mL（不同细胞系可能有差异，建议查文献或预实验摸一下）。处理完之后吸掉药液，用PBS洗两三遍，洗掉残留的丝裂霉素C，再正常做划痕。这样处理过的细胞，增殖基本被按了暂停键，接下来24到48小时内的伤口变化，就是迁移说了算。

踩坑提醒：丝裂霉素C是有毒的化疗药，操作一定戴手套在通风橱里配，别直接接触。另外浓度别太高、时间别太长，不然细胞不光不增殖，连命都没了，迁移也别想了。预实验一定要做，找到"增殖被抑制但细胞还活着且能爬"的甜蜜点。

 

6、划痕宽度控制

划痕这道"刀"怎么下，直接决定实验成败。划痕宽度控制是划痕实验里最考验手感的一环。标准做法是用10μL的枪头（或者200μL枪头，看你想要多宽），贴着培养板底，垂直、匀速地划一条直线。正常情况下宽度大约500到800微米，这个范围比较合适——太窄了细胞两小时就爬满了没意义，太宽了细胞爬半天都愈合不了，时间拉太长增殖干扰又回来了。

划的时候几个要点：第一，枪头要垂直拿，别斜着，斜着划出来的伤口一边宽一边窄，没法准确测量面积。第二，力度要均匀，轻轻贴着底划过去就行，别使蛮劲——用力过猛会把整片细胞都刮下来，伤口边缘参差不齐，那就毁了。第三，划痕尽量走直线，手要稳，新手可以拿直尺比着练几次找感觉。第四，划完之后一定用PBS轻轻洗两遍，把刮下来的游离细胞冲掉，不然这些碎细胞会重新贴回去，把伤口"假愈合"了。洗的时候动作轻一点，别把边缘的细胞也冲掉了。

还有个小技巧：划痕的时候可以多划几条平行的，形成网格状，这样每个孔里有多个伤口可以取平均值，数据更稳。但别划太密，伤口之间得留够细胞生长的空间，不然互相干扰。

 

7、固定视野拍照

最后一个关键步骤，也是最容易翻车的地方——拍照。固定视野拍照的核心要求是：0小时、6小时、12小时、24小时……每个时间点都要在同一个位置拍，曝光参数还得一致。不然你0小时拍的是伤口这头，24小时拍的是那头，面积怎么比？曝光不一样，ImageJ识别边缘的阈值也得跟着变，又乱套了。

怎么保证同一个位置？老办法是在培养板底下做个十字标记（用记号笔画），拍照时把十字对准视野某个固定位置，下次拍的时候再对准这个十字，位置就找回来了。现在有些高级显微镜有坐标记忆功能，存个坐标下次自动回去拍，那就更省事。不管用什么方法，总之你得能找回同一个点。

曝光参数这块，第一张照片（0小时）定好亮度、对比度、曝光时间之后，后面所有时间点都用同一套参数，别去调。如果0小时太暗想调亮，那也只在0小时调，调完记下来数值，后面照搬。拍照时物镜倍数也要固定，4倍或10倍比较常用——倍数太高视野太小看不到完整伤口，倍数太低伤口边缘看不清没法量面积。建议每个时间点、每个伤口多拍几张不同位置的，最后取平均，数据更靠谱。还有，细胞从培养箱拿出来拍照要快，拍完赶紧放回去，别让细胞在室温待太久影响状态。

划痕实验搞定了，咱们进阶到Transwell。这套实验比划痕复杂得多，但能模拟更接近体内的迁移和侵袭场景，是肿瘤转移研究的核心手段。

 

8、Transwell迁移实验原理

Transwell这套装置的核心是一层半透膜，把培养空间分成上下两个小室。Transwell迁移实验原理说白了就是：利用上下室不同的培养条件制造一个"诱惑"，让上室的细胞穿过膜跑到下室去。具体怎么诱惑？上室放无血清培养基（细胞饿着），下室放含血清或者趋化因子的培养基（有吃的），细胞感受到下面有好东西，就会从膜上面钻过去。一段时间后，数一数有多少细胞穿过来了，就知道迁移能力有多强。

跟划痕实验比，Transwell有几个优势。第一，它检测的是"趋化迁移"（chemotaxis），细胞是奔着浓度梯度主动跑的，更接近体内细胞跟着信号分子走的真实场景。第二，膜把上下隔开，穿过来的细胞是"真·迁移"的，不像划痕还有增殖干扰。第三，通过调整下室的趋化因子种类和浓度，你可以精确研究特定分子对迁移的影响，灵活性很高。当然代价就是操作复杂、变量多、容易翻车，下面咱们一个环节一个环节说。

图2. Transwell小室结构示意图：半透膜分隔上下两室，细胞从上室穿过膜迁移至下室

 

9、Transwell侵袭实验

迁移实验会了，侵袭实验就是在它基础上加一层"路障"。Transwell侵袭实验和迁移实验的区别就在于：迁移实验的膜是"裸"的，细胞直接穿过去就行；侵袭实验在膜上面铺了一层Matrigel基质胶，细胞得先降解、突破这层基质，才能穿到下面去。这层Matrigel模拟的是体内的细胞外基质（ECM）和基底膜，所以侵袭实验检测的是细胞"突破屏障"的能力，更贴近肿瘤细胞在体内侵袭转移的真实过程。

为什么要分迁移和侵袭两套？因为这两个能力不是一回事。有些细胞迁移能力强（能跑），但侵袭能力弱（不会"拆墙"）；反过来也有。肿瘤转移是个复杂过程，细胞既要会跑又要会拆，所以研究肿瘤恶性程度的时候，迁移和侵袭往往要一起做、对比着看。如果你的细胞穿迁移膜没问题但穿不过Matrigel，说明它运动能力够但降解基质的能力不行；如果两个都穿不过去，那基本可以判断这细胞运动能力本身就弱。

图3. 细胞侵袭基质胶过程：细胞分泌基质金属蛋白酶降解Matrigel，穿透基质胶与半透膜到达下室

 

10、基质胶(Matrigel)铺胶

侵袭实验最关键、最容易翻车的环节就是铺胶。基质胶(Matrigel)铺胶这步做好了，实验成功一半；做砸了，后面全白搭。Matrigel是从小鼠肉瘤里提取的基底膜基质，里面含有层粘连蛋白、IV型胶原这些ECM成分。它有个要命的特性——室温以上会很快凝固，所以全程都得在冰上操作。

铺胶流程是这样的：先把Matrigel从−20度或−80度拿出来，放到4度冰箱过夜缓慢解冻（千万别拿手里搓或者放室温化，一化就凝了）。解冻后用预冷的无血清培养基稀释，稀释比例一般1:6到1:10，浓度越高"墙"越厚越难过。稀释用的枪头、离心管全都要预冷，放冰上。取适量稀释好的Matrigel（一般上室加50到100微升），用预冷枪头沿着上室侧壁缓慢加入，别直接往中间倒，容易产生气泡。加完轻轻晃匀，让胶均匀铺满膜。然后放到37度培养箱孵育1小时左右，让Matrigel凝固成胶冻状。

致命提醒：基质胶一裂你就等着重新来吧！凝固过程中千万别晃动小室，晃了胶面不平甚至裂开，侵袭结果全废。孵育结束后轻轻吸掉没凝固的液体（有的方案会保留），然后用无血清培养基轻轻洗一次。整个铺胶过程建议在冰盒上操作，动作要快但手要稳。

 

11、趋化因子梯度

细胞凭什么要从上室往下面钻？因为有趋化因子梯度在"勾引"它。趋化因子梯度是Transwell实验的驱动力，说白了就是下室的"诱饵"比上室香，细胞闻着味儿就往下游跑。最常用的诱饵就是血清——下室加含10% FBS的完全培养基，上室是无血清的，血清里的生长因子和趋化因子形成浓度差，细胞就追着这个梯度迁移。

如果想研究特定趋化因子的作用，可以在10% FBS的基础上叠加特异性的趋化因子，比如SDF-1（CXCL12）就是常用的，它对表达CXCR4的细胞有很强的趋化作用。加多少、怎么加，得查文献摸浓度，一般纳克到微克每毫升这个量级。设置梯度的时候要注意：下室的体积要足够（一般500到800微升），液面要能接触到上室膜的底部，不然细胞穿过去之后掉到下室液体里数不到；但也不能太多把上室顶起来。上下室的液面差和浓度差一起构成了趋化动力，浓度差越大迁移越强，但太大了可能反而饱和，所以梯度也要预实验优化。

 

12、细胞饥饿处理

细胞种进Transwell之前，先得饿它一顿。细胞饥饿处理的目的有两个：一是清除细胞内残留的血清信号，让细胞对趋化因子更敏感、反应更强烈；二是让细胞周期同步化到G0/G1期，减少增殖对迁移的干扰。具体做法是：接种到Transwell之前，把细胞换到无血清培养基里养6到12小时（有的做24小时，看细胞耐受性）。

饥饿时间要把握好。太短了血清没清干净，细胞对下室的趋化因子反应迟钝，迁移数偏低；太长了细胞饿出问题，活力下降甚至凋亡，那迁移也别想了。一般6到12小时是个比较安全的窗口，大部分肿瘤细胞系都能扛住。饥饿完了之后收集细胞、计数，用无血清培养基重悬到合适浓度，再种到上室。重悬的时候吹打要轻柔均匀，保证单细胞悬液，别一团一团地种上去。接种密度也得控制好，太少了穿过去的细胞数不够统计，太多了细胞挤在一起影响迁移——一般24孔板的上室种2万到10万个细胞，具体根据细胞大小和迁移能力调整。

 

13、8μm孔径膜选择

Transwell膜的孔径不是随便选的，选错了细胞根本穿不过去。8μm孔径膜选择是针对贴壁肿瘤细胞的通用标准——像HeLa（宫颈癌）、MDA-MB-231（乳腺癌）这些常见的贴壁肿瘤细胞系，8μm的孔径刚好够它们挤过去但又不会太容易，能拉开不同迁移能力细胞之间的差距。

但不同细胞大小不一样，孔径也得跟着变。巨噬细胞个头大，8μm挤着费劲，得用12μm的膜；白细胞（比如淋巴细胞）个头小又灵活，8μm太宽松了没区分度，要用3到5μm的膜。选膜的总体原则是：孔径比细胞直径略小一点，细胞得"使劲"变形才能钻过去，这样测出来的才是主动迁移能力，而不是被动漏下去的。如果你不确定该用多大孔径，先查你用的细胞系的文献，看别人用的什么规格，照着来最稳妥。另外买Transwell的时候注意看产品说明，同一个小室规格可能有多种孔径可选，别买错了。

 

14、结晶紫染色计数

细胞迁移/侵袭结束了，怎么数穿过来的细胞？最经典的方法就是结晶紫染色。结晶紫染色计数的流程是：先把Transwell小室取出来，吸掉培养基，用PBS洗一下，然后放4%多聚甲醛里固定20分钟（室温）。固定完PBS再洗一遍，接着放到0.1%结晶紫染液里染色15到20分钟，染完用自来水或PBS轻轻冲洗掉多余的染料——冲洗的时候水流别对着膜冲，容易把细胞冲掉。染好之后，膜的下面（下室那面）会附着紫色的穿膜细胞，上室那面如果处理得当应该是干净的。

计数怎么数？可以用显微镜拍照后用ImageJ的Cell Counter插件手动点数——插件菜单Plugins → Analyze → Cell Counter，一个个点过去，适合细胞数不多的情况。如果细胞数多，也可以用ImageJ先转灰度、设阈值、用Analyze Particles自动计数，但自动计数对染色背景要求高，背景不均匀容易误判。不管手动还是自动，建议每个膜随机选5个以上视野拍照计数取平均，乘以整个膜的面积换算成总细胞数，这样数据更有代表性。拍照时记得低倍镜（4倍或10倍）先全貌、高倍镜（20倍）再细节。

图4. 结晶紫染色结果：穿膜细胞被染成紫色，通过计数可量化细胞迁移与侵袭能力

 

15、棉签擦拭上室

最后这个步骤看着不起眼，但做不好前面全白干。棉签擦拭上室是染色计数前的一道"清场"工序。为什么要擦？因为种在上室的细胞，大部分并没有穿膜，它们还贴在上室那面的膜上。如果不把这些"没本事穿过去"的细胞擦掉，染色的时候它们也会被染成紫色，到时候你分不清哪些是穿过去的、哪些是赖在上面的，计数就全乱套了。

具体操作：固定之后（注意是固定之后，固定之前擦会把要数的穿膜细胞也带掉），用湿润的棉签轻轻擦拭上室那面的膜。棉签要先蘸湿PBS或水，挤掉多余水分保持微湿就行。擦拭的力度——这个真得靠手感，棉签轻微弯曲那个力度差不多，轻轻转着擦两三圈。力度太轻擦不干净，上室残留细胞干扰计数；力度太重就麻烦了，棉签擦太使劲把膜都擦破了那就真的芭比Q了，膜一破这个样本直接报废，没救。新手建议先拿废弃的Transwell练几遍找手感，别拿正式样本上手。擦完之后可以低倍镜快速看一下上室面是否干净，确认没问题再进行染色。这一步做好了，你最后拍到的紫色细胞才是真·穿膜的，数据才经得起检验。

师兄的最后嘱咐：Transwell实验变量多，每一步都可能翻车。建议正式实验前先做一次预实验，把铺胶、接种密度、迁移时间这些参数摸清楚。迁移时间一般12到24小时，侵袭因为要过基质胶会更久，可能24到48小时。宁可多做几个时间点也别只做一个，数据点越多趋势越清楚。还有，每组至少做3个复孔，这是底线。

划痕和Transwell这两套实验，一个是简单直接的伤口愈合模型，一个是精密复杂的趋化迁移侵袭模型，各有各的用武之地。做肿瘤转移、伤口修复、药物筛选的同学，这两个实验基本是标配。新手刚上手肯定会翻几次车——划痕划歪了、Matrigel凝坏了、膜擦破了——这些都是学费，别气馁。多练几次手感就来了，等你做到闭着眼睛都能铺出平整的基质胶、棉签一擦力度刚刚好的时候，你也就成了师弟师妹们眼里的"实验大神"了。实验这事儿，没别的捷径，就是多练、多想、多总结。祝大家实验顺利，数据漂亮，Paper多发！