细胞增殖与周期检测实战指南：从 CCK-8 到流式 PI 染色全流程解析｜踩过坑的师兄师姐手把手带你跑实验

刚进实验室，老板扔给你一句话"把细胞增殖和周期都做一下"，你一脸懵圈不知道从哪下手——这篇文章就是写给这种时候的你。说白了，增殖看的是"细胞会不会变多"，周期看的是"细胞卡在哪一步"，两件事看着像，其实测的是完全不同的东西。下面我按"先增殖、后周期"的顺序，把踩过的坑一并交代清楚，照着走基本不会翻车。

一、细胞增殖检测

增殖这块方法多得能挑花眼，但万变不离其宗：要么测"细胞代谢有多活"（活力法），要么直接看"细胞有没有真的在分 DNA"（掺入法、克隆法）。两种思路不能混为一谈，下面一个个掰开讲。

 

1. CCK-8 检测原理

首先要说现在实验室最常用的 CCK-8 检测原理。它的核心就一句话：活细胞里那种忙前忙后的线粒体脱氢酶，会把试剂里的 WST-8 还原成橙黄色的甲臜（formazan），这东西水溶性好，直接溶在培养基里。你在 450 nm 那个波长读个吸光度，颜色越深说明活细胞越多、代谢越旺，吸光度就成正比地反映细胞活力。

图1:CCK-8 工作原理：活细胞线粒体脱氢酶把 WST-8 还原成橙黄色水溶性甲臜，450 nm 测吸光度即可反映细胞活力。

 

好处是显而易见的：试剂加进去孵育 1～4 小时就能上酶标仪，不用裂解、不用另配溶液，对细胞也无毒（至少短期内），做完还能拿同一批细胞继续干别的。所以药物毒性筛选、细胞活力曲线，CCK-8 基本是首选。

但是——CCK-8 孵育时间得自己摸索，照搬文献你就等着翻车。不同细胞代谢快慢差远了：肿瘤细胞可能 1 小时就爆表，原代细胞磨叽 3 小时还没颜色。先做个时间梯度（0.5/1/2/4 h），选吸光度落在 1.0～2.0 之间、且对照组明显区别于空白孔的那一档，别一上来就死磕文献的"2 小时"。

还有，培养基里的酚红和血清会轻微影响本底，记得设"只加培养基不加细胞"的空白孔扣背景。

 

2. MTT 比色法

说完新宠说老前辈。MTT 比色法 是经典中的经典：活细胞里的琥珀酸脱氢酶把黄色的 MTT 还原成蓝紫色的甲臜结晶。注意，是"结晶"——这玩意儿水不溶，会哐哐砸在细胞里。所以你得先把培养基吸掉，加 DMSO 把结晶溶解出来，再在 570 nm 测吸光度。

MTT 的优点是便宜、文献铺天盖地好对比，缺点也明显：要吸液、要加 DMSO、步骤多，而且 MTT 结晶这步本质上把细胞弄死了，做不了后续实验。现在大家都嫌它麻烦，能上 CCK-8 就上 CCK-8，但老板要你"和十年前那篇文章对齐数据"的时候，MTT 还得会做。

踩过坑的都知道：MTT 那步溶解经常"溶解不均匀"，孔与孔之间差出 20% 不是梦。加完 DMSO 一定要在摇床上低速晃 10～15 分钟，等颜色完全均匀再读，别心急。

 

3. WST-8 水溶性甲臜

接着把上面那个"水溶性"拎出来单讲——WST-8 水溶性甲臜 是 CCK-8 试剂的核心成分，也是它比 MTT 好用的根本原因。MTT 产物不溶于水，要 DMSO 兜底；而 WST-8 被还原后生成的甲臜是水溶性的，直接溶在孔里，一步法搞定，不用额外溶解步骤。这就是为什么 CCK-8 做起来"丝滑"，而 MTT 总让人手忙脚乱。

换句话说，你在 CCK-8 和 MTT 之间纠结，本质就是在纠结"要不要那一步溶解"。能省一步就少一个出错点，所以现在 CCK-8 才铺得这么广。

 

4. EdU 掺入检测

前面 CCK-8、MTT 测的是"代谢活不活"，但细胞代谢活不代表它真的在分 DNA。EdU 掺入检测 才是真·看 S 期的：5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）长得像胸腺嘧啶，会冒名顶替掺进新合成的 DNA 里。然后用 Click 反应给乙炔基挂个荧光基团，荧光显微镜或流式一读，S 期细胞亮得明明白白。

EdU 比 BrdU（下面要讲）省心在不用变性 DNA、不用抗体，Click 反应又快又特异。你想看"给药后到底有多少细胞进入 S 期"，EdU + 流式几乎是无脑首选。

 

5. BrdU 掺入检测

然后是老一代的 BrdU 掺入检测。5-溴脱氧尿苷（BrdU）同样是胸苷类似物，掺到新合成 DNA 里，但它的检测靠的是抗 BrdU 抗体——这就麻烦了：抗体要钻进 DNA 里去认 BrdU，DNA 双链得先变性（酸或热）打开，这一变性把细胞折腾得不轻，背景还高。

所以现在新实验基本都换 EdU，但你要接续历史数据、或者复现老protocol，BrdU 这套你得会。两者反映的都是 DNA 合成活性，思路一脉相承，只是"标记+检测"的手段换了。

 

6. 平板克隆形成实验

前面那些都是"短平快"，要看细胞长期的、单个的增殖能力，还得靠 平板克隆形成实验。说白了就是给细胞装个 GPS 定位：把单细胞悬液稀稀拉拉铺进孔板（一般每孔 100～1000 个，看你细胞脾气），培养 2 周左右，等单个细胞长成一坨肉眼可见的克隆，再结晶紫染色，数"超过 50 个细胞"的克隆有多少个。

图2:平板克隆形成实验：单细胞贴壁增殖 2 周后结晶紫染色，计数>50 个细胞的克隆，反映细胞独立增殖与集落形成能力。

 

克隆形成率 = 克隆数 / 接种细胞数 ×100%，它反映的是"一个细胞能不能真正独立地、不受群体掩护地把一摊细胞长出来"——这才是增殖能力的硬指标，比 CCK-8 那种"代谢旺盛"更贴近"细胞会不会变多"。

克隆实验最大的坑是"接种不均"和"细胞抱团"。铺板前一定要把细胞吹散成真·单细胞悬液，铺完轻轻"十字摇匀"，别来回猛晃把它们又摇成一堆。培养中途尽量少开盖、少换液，扰动越少越好。

 

7. 细胞活力与增殖区分

最后把这一板块的"心法"讲清楚——细胞活力与增殖区分 是新手最容易混的地方。活力检测（CCK-8、MTT）测的是代谢活性，回答"细胞还活不活、还有没有劲儿"；增殖检测（EdU、BrdU、克隆形成）测的是细胞分裂能力，回答"细胞有没有真的在变多、在传代"。

举个反直觉的例子：你给细胞加个低毒药物，CCK-8 一读吸光度没怎么掉，你以为"细胞没事"——可 EdU 一做发现 S 期细胞少了一大半，其实是被药物"冻"在 G1 不往前走了，代谢还活着但早就不增殖了。所以一句话：活力正常 ≠ 增殖正常，要回答"细胞在不在长"，光看 CCK-8 是不够的，得配上 EdU 或克隆实验交叉验证。

 

二、细胞周期检测

增殖说完，进入周期。周期检测的核心思路是：用染料给 DNA 上色，根据"每个细胞 DNA 含量的多少"把细胞分到 G1、S、G2/M 不同时相里去。主流方法就一个——PI 染色 + 流式，下面把这条线从头到尾捋顺。

 

8. 细胞周期时相（G1/S/G2/M）

先把基本概念对齐。细胞周期时相（G1/S/G2/M） 是这样划的：G1 期是 DNA 合成准备阶段，细胞攒资源、长个儿；S 期是 DNA 真复制阶段，DNA 含量从 2N 涨到 4N；G2 期是分裂前最后的准备，查 DNA 复制有没有出错；M 期是有丝分裂，一分为二。此外还有个 G0 期，是细胞退出周期、静止休眠的状态，不再往前走。

图3:细胞周期时相：G1 期 DNA 合成准备、S 期 DNA 复制（2N→4N）、G2 期分裂准备、M 期有丝分裂，G0 期为静止休眠态。

 

为什么要先记住这个？因为后面 PI 染色的整张直方图，本质就是在用"DNA 含量"反推"细胞处于哪个时相"。脑子里没有这张时相图，你看直方图就是看天书。

 

9. PI 碘化丙啶染色

主角登场——PI 碘化丙啶染色。PI（propidium iodide）是个嵌入型染料，能插到双链 DNA 的碱基对之间，一插进去就发红色荧光，荧光强度和 DNA 含量成正比。但 PI 有个脾气：它没有膜通透性，活细胞的膜它进不去，所以做周期必须先把细胞固定（让膜出洞）再染色。

还有个更要命的细节：PI 不挑食，DNA 和 RNA 它都结合。要是 RNA 不除掉，你测的"DNA 含量"里混了一堆 RNA 的份，G1 峰就糊了。这就是为什么后面一定要跟 RNase 这一步（关键词 12）。

安全第一：PI 是剧毒致癌物，手套戴好了，口罩也别省。称量、配液都在通风橱里搞，废液单独收，别往水槽里倒。这种事没必要拿命去试。

 

10. 流式细胞术检测

染完色上机，就是流式细胞术检测。PI 的激发峰在 488～535 nm 附近，发射在 617 nm 左右，所以用 488 nm 激光器激发，FL2 通道（一般 585/42 nm 带通）采集信号。设置上，FSC、SSC、PI-A（面积）、PI-W（宽度）这几个参数都要设成线性模式——记住是线性不是 log！因为 DNA 含量是连续的量，log 模式会把 G1 和 G2 的相对关系全拧乱。

为什么要 PI-A 还要 PI-W？为了通过"面积-宽度"双参数门把粘连的双粘连体踢出去：两个 G1 细胞粘在一起跑过去，DNA 总量等于 4N，会被误判成 G2/M。用 W（脉冲宽度）一看，双粘体宽度明显更宽，一门就能剔除。这一步不做，你的 G2/M 峰就是假的。

 

11. 70% 乙醇固定

回到样品处理——70% 乙醇固定 是周期检测的"地基"。正确做法是：用 -20°C 预冷的 70% 乙醇，逐滴加入边摇晃的细胞悬液里（一滴一滴加，别一坨倒进去），然后 4°C 避光固定至少 30 min，最优是过夜。这样能保持细胞核完整性、让膜出洞好进 PI，又不会把 DNA 搞碎。

关键就两个字"逐滴"。一口气把冷乙醇倒进去，细胞瞬间脱水会皱成一团，核变形、DNA 断裂，后面 G1 峰又宽又矮。固定完可以在 4°C 乙醇里放几天甚至一两周再做，所以这一步经常"今晚固定、明天/后天染色"，节奏好把控。

 

12. RNase 降解 RNA

固定完、洗掉乙醇，接下来就是RNase 降解 RNA 这一步。用 RNase A（终浓度 50 μg/mL 左右），37°C 水浴避光孵育 30 min，把 RNA 彻底降解掉，消除 PI 对 RNA 的非特异性结合干扰。

RNase 这一步偷懒你的 G1 峰就变成大宽峰——RNA 没降解干净，PI 一通乱染，G1 那个本该尖尖的峰被 RNA 信号糊成一坨，S 期和 G1 分不开，整图基本报废。所以 RNase 浓度要够、时间要足、温度别凉，别图省事。

 

13. DNA 含量分析

染色、上机、拿到直方图，就到了DNA 含量分析。原理是：G1 期细胞 DNA 含量是 2N（一个拷贝），G2/M 期是 4N（两个拷贝），S 期正在复制、DNA 含量介于 2N 和 4N 之间。所以直方图上最左边那个尖峰是 G1（2N），最右边那个小尖是 G2/M（4N），中间那段"坡"就是 S 期。通过荧光强度分布，用软件（FlowJo、ModFit 之类）拟合，就能算出各期比例。

图4:PI 染色 DNA 含量直方图：左尖峰为 G1 期（2N），右尖峰为 G2/M 期（4N），中间过渡区为 S 期，G1 峰左侧若出现亚二倍体信号即为 Sub-G1 凋亡峰。

 

判图有两条铁律：一是 G1 峰的 CV（变异系数）要小，正常应该 <5%～8%，CV 大说明固定/染色/RNase 哪一步出问题；二是 G2/M : G1 的荧光比值应接近 2，偏离太多就是没设线性、或者粘连体没剔干净。

 

14. 细胞同步化

有时候你不只是看"自然分布的周期"，而是想让细胞齐刷刷卡在某一个时相——这就需要细胞同步化。最常见也最便宜的是血清饥饿法：把培养基换成无血清或低血清，培养 24～48 h，细胞因没"营养信号"而阻滞在 G0/G1 期，一加回血清就齐刷刷重新进入周期，方便你做时间梯度抓 S 期。

更"狠"的同步化还有：胸苷阻断法（thymidine block，让 DNA 复制卡在 S 期初，可单阻断也可双阻断）、诺考达唑阻断法（nocodazole，破坏纺锤体把细胞卡在 M 期）。做时间分辨的周期实验，先同步、再释放、再分时间点收样，是标准套路。

血清饥饿别太久。48 h 以上细胞要么饿死、要么进 G0 出不来，释放后周期恢复反而乱。同步化和"细胞状态"是跷跷板，过度同步=过度折腾，找平衡点很关键。

 

15. 凋亡峰（Sub-G1）

最后留一个"意外收获"——凋亡峰（Sub-G1）。在 PI 周期直方图上，G1 峰（2N）的左边、也就是 DNA 含量小于 2N 的位置，有时会出现一个独立的峰，这就是亚二倍体峰（Sub-G1 峰）。它的来历是：凋亡发生时，细胞内源性的核酸内切酶激活，把 DNA 在核小体间切成片段，这些小片段在固定/洗脱时漏出细胞外，剩下细胞里的 DNA 总量就不到 2N 了，于是跑到 G1 左边。

所以 Sub-G1 峰是凋亡的标志——但要注意，它只能提示凋亡、不是金标准。破碎的细胞、机械损伤、坏死碎片都可能制造假阳性。要确认凋亡，最好再用 Annexin V/PI 双染、Caspase 活性这些方法交叉验证，别拿一个 Sub-G1 就敢写"细胞发生凋亡"。

 

增殖检测回答"细胞会不会变多"——CCK-8/MTT 看代谢活力（WST-8 水溶性甲臜让 CCK-8 比 MTT 省一步），EdU/BrdU 看 S 期 DNA 合成，克隆形成看长期独立增殖；周期检测回答"细胞卡在哪一步"——PI 染 DNA、流式读荧光，靠 2N/4N 的 DNA 含量分布把 G1/S/G2/M 分开，固定、RNase、线性模式、剔双粘体是四大命门，同步化帮你抓特定时相，Sub-G1 还能顺手提示凋亡。

活力正常不等于增殖正常，增殖正常不等于周期正常。三个层面各自有各自的指标，别拿 CCK-8 一条曲线就下结论，交叉验证才是正经做实验的态度。照着这篇走，新手基本能少走一两周弯路。祝你的 G1 峰又尖又窄，CV 永远 <5%。