Q:ChIP-Seq中的测序DNA样本需要多少产量?
通常是≥10ng。随着目前建库技术的不断完善,低至5ng的DNA量也能被建库成功;少数测序公司为了降低自身风险提出20ng的要求,通过可以协商降低该送样要求。尤其是一些转录因子,最终能够捕获的DNA量会很低。
Q:ChIP-Seq中的测序DNA样本需要多少产量?
通常是≥10ng。随着目前建库技术的不断完善,低至5ng的DNA量也能被建库成功;少数测序公司为了降低自身风险提出20ng的要求,通过可以协商降低该送样要求。尤其是一些转录因子,最终能够捕获的DNA量会很低。
Q:样品制备过程中是否需要PCR扩增?PCR扩增后是否会影响最后的结果?还有哪些因素会影响ChIP-Seq的结果?
如果ChIP下来的DNA样品量非常少,在样品制备过程中通常需要经过一步PCR扩增的过程,PCR扩增主要是为了获得足够上机反应的DNA量。如果客户能够提供足够量的DNA样品,那就不需要再进行PCR扩增。由于是线性扩增,扩增前后的结果很相似,基本上不会影响测序结果。抗体的质量,特异性,ChIP的实验操作,实验设计方法,DNA片段长度范围,测序通量和质量等都会影响ChIP-Seq的结果。
Q:导致ChIP-seq测序假阳性比较高的原因有哪些?
(1)染色质开放程度的不均一性、DNA打碎方法、PCR扩增偏向性、基因组的重复程度以及测序和序列比对过程中的错误都会引入系统误差造成假阳性,测序后首先将序列比对到已知基因组上并确立真正的结合位点。 (2)对于转录因子,要寻找“峰”对应的下游调控基因(靶基因),或者构建转录因子结合位点的保守结合序列,如果转录因子的motif是已知的,则可以计算“峰”序列中包含motif序列的百分比,间接估计实验结果的可靠性。
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