双荧光酶数据分析指南!!!

01.实验背景

    双荧光素酶报告基因实验（Dual-Luciferase Reporter Assay）是一种广泛应用于基因调控机制研究的经典技术，通过同时检测两种荧光素酶—萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）的活性，实现对目标基因表达或分子互作的定量分析。

核心原理：

    将待研究的调控元件（如启动子、miRNA靶序列等）插入报告基因载体中，与萤火虫荧光素酶基因相连；海肾荧光素酶作为内参，用于标准化实验误差（如细胞数量、转染效率差异）。

优势：

    双报告系统通过计算萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性的比值（Firefly/Renilla），显著提高数据的可靠性和重复性。

 

02.实验分组设计

    实验分组的设置需根据研究目标（互作类型）灵活调整，以下为常见场景示例：

1. miRNA与靶基因互作验证

分组设计：

    实验组：共转染miRNA模拟物（mimics） + 含靶基因3'UTR的报告载体

    对照组：

    靶基因3'UTR报告载体 +  miRNA阴性对照（NC mimics）。

    突变型3'UTR报告载体（关键结合位点突变）+miRNA模拟物。

分组案例展示：

2. 启动子与转录因子互作验证

实验组：

    共转染转录因子表达载体 + 含目标启动子的报告载体（Firefly Luciferase） + 内参报告载体（Renilla Luciferase）。

对照组：

    空载对照组：转录因子表达载体替换为空载体。

    突变启动子对照：将启动子关键结合位点突变后构建报告载体。

分组案例展示：

 

03.数据分析方法

 

1. 数据标准化

    计算Firefly/Renilla比值（相对荧光值），消除细胞数量和转染效率的干扰。

    公式：相对活性=Firefly Luciferase活性 / Renilla Luciferase活性

    例如：120428/ 1972≈ 61.06896552 依次计算出每个重复的相对荧光值

2.数据归一化分析

    将数据进行归一化处理：以组间NC-mimics + F-box-WT平均值为对照，其余各组除以NC-mimics + F-box-WT组的平均值，计算出相应的数据。

3. 统计学分析

比较实验组与对照组：

    miRNA靶向实验：实验组（miRNA mimics）的相对荧光值显著低于阴性对照组，而突变靶序列组活性恢复。

    启动子活性实验：实验组（转录因子过表达）的相对荧光值值显著高于空载对照组，且突变启动子组活性降低。

统计方法：

    使用t检验（两组比较）或单因素方差分析（ANOVA）（多组比较），判断差异显著性（通常要求*P<0.05，**P<0.01）。

    数据需至少重复3次独立实验，以平均值±标准差（Mean±SD）呈现。

(1)将归一化后的数据复制到软件GraphPad prism中。

(2)将NC-mimics + F-box-WT和MiR-1256-mimics + F-box-WT、NC-mimics + F-box-MT和MiR-1256-mimics + F-box-MT分别进行显著性差异。

4.结果可视化

根据显著性分析结果以及归一化数据绘制柱状图，如下图所示。

 

04.借助Deep seek处理双荧光素酶实验数据

 

操作方法

    - 上传CSV或Excel数据文件，输入指令如“帮我计算各组每个样品的萤火虫荧光素酶FLU信号值/海肾荧光素酶RLU信号值，得到Luc/Ren比值，求各组平均值（AVG）和标准差值（SD）,然后将数据进行归一化处理：以组间NC-mimics + F-box-WT平均值为对照，其余各组除以NC-mimics + F-box-WT组的平均值，

    最后使用归一化后的数据将NC-mimics + F-box-WT和MiR-1256-mimics + F-box-WT、NC-mimics + F-box-MT和MiR-1256-mimics + F-box-MT分别进行显著性差异，根据归一化后的数据及显著性分析结果做柱状图”。

Deep seek 输出结果如下

- 复制代码，使用Python的matplotlib库，一键生成柱状图。

    备注：如果没有用python 的习惯，也可以只用Deep seek 进行数据分析，分析完成以后，使用GraphPad prism 或其他软件绘制柱状图。

 

05.注意事项

    内参必要性：必须设置Renilla Luciferase作为内参，避免实验误差。

    重复实验：生物学重复和技术重复需同步进行。

    质控步骤：转染后需检测细胞状态，避免毒性干扰。

    通过合理的分组设计和严谨的数据分析，双荧光素酶实验能够高效揭示基因调控、分子互作等关键机制，为功能基因组学研究提供可靠依据。

    双荧光素酶实验在生命科学研究中发挥着重要的作用，为解决更多生物学难题提供了强有力的技术支撑。武汉金开瑞能够提供包括双荧光素酶实验、荧光素酶蛋白互补实验（LCA）、双分子荧光互补（BIFC）等技术服务，从方案流程设计到技术试验执行，从科研技术服务到成品试剂盒提供，金开瑞实验平台满足您的一切需求，期待与您一起携手合作。