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长链非编码RNA LINC00473通过分泌microRNA-195-5p上调PD-L1促进胰腺癌进展

信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2019-07-26 09:00:23

题目：Long noncoding RNA LINC00473 drives the progression of pancreatic cancer via upregulating programmed death-ligand 1 by sponging microRNA-195-5p.
期刊：J Cell Physiol（IF= 4.522）
主要技术：双荧光素酶实验、AGO2-RIP、RNA pulldown
研究背景
       胰腺癌（Pancreatic cancer ，PC）被认为是致命的恶性肿瘤，伴随着高死亡率和不良预后，其在全世界日益成为严重的健康负担。虽然手术，化疗和放射治疗可以轻度缓解PC患者的症状，但由于缺乏有效的诊断标志物在初始阶段监测PC及预测预后，PC仍然面临不令人满意的临床结果。因此，迫切需要寻找其他可能的PC治疗方法。最近，程序性死亡配体1（PD-L1），已被用于肿瘤治疗，作为多种肿瘤的治疗靶点，尤其是PC。PD-L1充当T细胞活化的负调节分子，通过与PD-1的互做，改变免疫监视状态从而介导肿瘤进展。在临床结果不佳的PC患者中报告了PD-L1的过度表达。已经证明几种非编码RNA可以下调PD-L1，从而提高靶向治疗的治疗效果。因此，该研究旨在研究lncRNA、miRNA在PC进展中潜在的分子机制。
研究内容及结果
1. LINC00473 与PD-L1在PC中上调，miR-195-5p在PC中下调，并且PD-L1的高表达与预后不良有关
作者首先检测了134例PC组织及20例正常胰腺组织，通过IHC发现PD-L1主要表达在细胞膜上，PC组织中PD-L1阳性率（57.69％）显著高于正常胰腺组织（23.53％，p <0.05；图1）。此外，临床病理资料分析显示，PD-L1阳性表达与肿瘤分期、肿瘤大小、LNM和远处转移密切相关（p <0.05），而与与年龄、性别、神经周围侵犯及肿瘤分化无关。随后，对85例PD-L1阳性及49例PD-L1阴性患者进行Kaplan-Meier生存分析，发现PD-L1阳性的PC患者的总体存活期比PD-L1阴性的患者短（p <0.05；图2），提示高表达的PD-L1与不良预后相关。
       随后，对于PC组织及正常组织中的LINC00473、PD-L1及miR-195-5p表达进行了检测，发现相较于正常组织，LINC00473、PD-L1表达上调，而miR-195-5p表达下调（图3a、b、c）。此外，作者还在正常胰腺细胞系H6C7及PC细胞系SW-1990、Panc-1、BxPC-3、AsPC-1及CAPAN-2检测了LINC00473的表达，发现相较于H6C7，LINC0047在所有PC细胞系中均表达较高，且在SW-1990中表达最高（图3d），因此后续也选用SW-1990细胞系开展机制研究。
图1   PD-L1在PC组织中高表达
图2   PD-L1高表达与PC患者总体生存率低下相关
图3   LINC00473 与PD-L1在PC中上调，miR-195-5p在PC中下调
2. miR-195-5p可以靶向调控PD-L1的表达，过表达miR-195-5p可以通过下调PD-L1表达抑制PC进展
通过生物信息学预测可以发现，miR-195-5p和PD-L1存在可能的互作位点（图4a）。随后通过双荧光素酶实验发现野生型的PD-L1序列组通过mimics过表达miR-195-5p后荧光强度下降；而将预测到的miR-195-5p和PD-L1结合位点突变之后荧光强度恢复到对照组水平，说明miR-195-5p和PD-L1的确可能通过该位点发生互作（图4b）。加入miR-195-5p mimics后可以发现PD-L1的mRNA及蛋白水平均出现了下降，和加入PD-L1的抑制剂Atezolizumab后的情况类似（图4c、d、e）。上述实验说明miR-195-5p可以靶向下调PD-L1的表达。
       接着，分别采用EdU染色、TUNEL染色、细胞划痕和transwell实验检测了miR-195-5p对SW-1990肿瘤生物学指标的影响，发现miR-195-5p过表达可以抑制细胞增殖（图5a、b），增加细胞凋亡（图5c、d），降低细胞迁移和侵袭能力（图5e、f、g、h）。同时，miR-195-5p过表达还可以调控凋亡相关蛋白BCL-2、Bax，细胞迁移侵袭相关蛋白MMP2、MMP9（图5i、j、k）。对上述因子的调控均和PD-L1抑制剂Atezolizumab的效果一致，说明miR-95-5p可能通过下调PD-L1表达抑制PC进展。
图4   miR-95-5p靶向下调PD-L1的表达
图5   miR-95-5p可以通过下调PD-L1表达抑制PC进展
3. LINC00437可以miR-159-5p的ceRNA形式上调PD-L1表达，而当LINC00437表达下调时PC进展亦受抑制
原位荧光杂交显示LINC00437主要定位在细胞质（图6），提示其作为ceRNA的可能。随后采用生物信息学预测，发现了LINC00437与miR-159-5p潜在的结合位点（图7a）。在采用双荧光素酶实验证实LINC00437和miR-159-5p的确可能在上述位点发生互作后，作者接下来分别采用AGO2-RIP与RNA pulldown确定了LINC00437和miR-159-5p的互作关系。当干扰LINC00437表达后，miR-159-5p表达显著上升，PD-L1表达显著下降；而当同时干扰LINC00437与miR-159-5p后，PD-L1的表达恢复到对照组水平。PD-L1蛋白的表达也存在同样趋势。上述实验说明LINC00437可以结合并调控miR-159-5p，并通过其调控PD-L1的表达。
       继续分别采用EdU染色、TUNEL染色、细胞划痕和transwell实验检测LINC00437对SW-1990细胞肿瘤生物学指标的影响，发现干扰LINC00437过表达可以抑制细胞增殖（图8a、b），增加细胞凋亡（图8c、d），降低细胞迁移和侵袭能力（图8e、f、g、h）。同时，LINC00437低表达还可以调控凋亡相关蛋白BCL-2、Bax，细胞迁移侵袭相关蛋白MMP2、MMP9（图8i、j、k）。同时，挽救实验也证实同时干扰LINC00437与miR-159-5p表达后细胞肿瘤生物学指标得到回复，说明LINC00437对细胞肿瘤进程的影响是通过miR-159-5p介导的。
图6   LINC00437主要定位在细胞质
图7   LINC00437可以ceRNA形式通过miR-159-5p调控PD-L1的表达
图8   LINC00437低表达可以抑制PC进展
4. LINC00473可通过吸附miR-195-5p调控PD-L1表达，从而影响CD8+细胞活化
在SW-1990细胞中干扰LINC00473及miR-195-5p后，将这些细胞与CD8+细胞共孵育，随后采用ELISA检测了细胞培养上清中细胞因子的含量，发现干扰LINC00473表达组可导致促瘤细胞因子IL-10浓度下降，抑瘤细胞因子IFN-γ与IL-4浓度上升；而同时干扰LINC00473与miR-195-5p组上述细胞因子浓度均回归到对照组水平（图9a）。继续检测共培养处理后的CD8+细胞发现，干扰LINC00473表达组CD8+细胞凋亡减少，PD-1及PD-L1表达减少；同时干扰LINC00473与miR-195-5p组CD8+细胞凋亡水平及PD-1、PD-L1表达水平与对照组相当；过表达LINC00473组CD8+细胞凋亡水平上升，PD-1及PD-L1表达增加（图9）。
图9   LINC00473过表达影响CD8+细胞活化
文章小结
       在PC细胞中，LINC00473作为结合miR-195-5p的ceRNA发挥功能，上调PD-L1及其受体PD-1，从而抑制CD8+ T细胞活化并促进PC的进展；LINC00473沉默或过表达miR-195-5p过下调PD-L1及其受体PD-1抑制细胞增殖，迁移和侵袭，促进PC的细胞凋亡，从而防止PC的发生。
 
 
 
 
 

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