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知无不“研”| PCR超全实验操作视频及实例protocol（视频+直播，实验从入门到精通)

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2020-07-24 09:13:17

近日，2019 年全国青少年科技创新大赛的一项获奖作品引发人们关注。这位获奖同学在实验记录中写到：2018.1.13 了解PCR技术的原理，知道PCR引物的设计......

（图片来源于https://www.sohu.com/a/407591540_600553?_trans_=000014_bdss_dklzxbpcgP3p:CP=）

那究竟什么是PCR？PCR的实验原理是什么？PCR实验怎么做？莫慌！请听小编一一为大家解答~

PCR简介

PCR (Polymerase Chain Reaction)，中文翻译为聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今，PCR技术已广泛应用于生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、人类学等领域。

实验流程举例说明

01 扩增样本数据分析

02 PCR扩增需准备的试剂

03 PCR扩增需准备的仪器

PCR仪

04 PCR扩增需要的程序

扩增样品主要有两个参数需要注意，一个是退火温度，一个是延伸时间，退火温度是根据GC含量决定的，通过软件分析，它的GC含量属于正常水平，所以我们设置56°。延伸时间是由扩增基因片段长度决定的，我们所使用的扩增酶pfu酶理论上每分钟可以扩增2000bp，扩增的样品大小大概660bp左右，所以设置30s应该是足够了。

05 PCR反应后，点胶检测其大小，待回收大小正确的目的片段

06 结果展示与分析

07 常见问题与解答

1、Q: 不出现扩增条带？

A: 在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病。例如，模板中含有杂蛋白质，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦不宜随意更改。

2、Q: 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，但其条带更整齐，亮度更高（假阳性）？

A: 出现假阳性的原因有：①引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。因此，需重新设计引物。②靶序列或扩增产物的交叉污染。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及枪头等均应一次性使用。

3、Q: 出现非特异性扩增条带？

A: 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

4、Q: 出现片状拖带或涂抹带？

A: 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度，适当降低Mg2+浓度。③增加模板量，减少循环次数。

完结撒花