BiFC还是LCA？你的蛋白互作该用哪种荧光互补技术？

在蛋白-蛋白互作研究中，荧光互补技术因其直观、原位、无需裂解细胞等优势，成为越来越多科研人员的首选。

但面对BiFC（双分子荧光互补） 和LCA（萤光素酶互补实验） 这两项技术，很多人会有疑问：它们有什么区别？我的实验该选哪一个？

今天，我们结合金开瑞荧光系列实验服务的实际经验，把这两种技术讲清楚。

 

一、BIFC技术

01、BiFC：看蛋白互作发生的“位置”

技术原理

双分子荧光互补（BiFC）技术将荧光蛋白（如YFP）切成N端和C端两个不发光的片段，分别与待测蛋白A和B融合。

◆ BiFC系统包含两个质粒，一个质粒上带有到YFP蛋白的N端1-173个氨基酸

（YN173），另一个质粒上保留YFP蛋白C端155-238位（YC155）；此设计可以增强弱互作蛋白的荧光信号。将待测蛋白A和B分别构建到两个载体上。

◆ 载体上分别带有Myc标签和HA标签，可供WB验证。

◆将待测蛋白A和B分别构建到两个载体上，与YFP的N部分和C部分分别融合表达，如果A和B蛋白能够结合，则YFP的两个部分也能重新组合在一起发出荧光。

简单说：有荧光= 有互作，荧光在哪里 = 互作发生在哪里。

 

 

02、实验流程（基于金开瑞服务）

载体构建：将蛋白A基因构建到YN173载体，蛋白B基因构建到YC155载体

转化注射：转化农杆菌后注射烟草叶片（植物）或转染293T细胞（动物）

观察拍照：24-48小时后，荧光显微镜下拍照，每组每个视野拍摄荧光、明场及融合照片

 

03、对照设置

组别	质粒组合	预期结果
阳性对照	YN173-P1 + YC155-P2	有荧光
阴性对照	YN173 + YC155（空载）	无荧光
实验组	YN173-A + YC155-B	根据互作情况定
两个单分子阴性对照	YN173-A + YC155 或 YN173 + YC155-B	无荧光

✅ 实验成功标准：阳性对照有荧光，阴性对照无荧光

 

04、案例展示

植物BiFC：金开瑞实验交付图（烟草叶片中可见清晰的荧光信号）

如何看结果？

1、默认分组方式如左图所示，每组每个视野都会拍摄荧光、明场以及融合3张照片；

2、“YN173-P1 + YC155-P2”为阳性对照，“P1”和“P2”是已知能够互作的蛋白，我司使用SPX4蛋白作为阳性对照，该蛋白能够与自身形成二聚体，

3、“YN173 + YC155”为阴性对照，转染的一对空载质粒，不会检测到荧光；

4、“YN173-A + YC155-B”为实验组，“A”和“B”指代待验证是否互作的一对蛋白，在阴阳性对照正常的情况下，如果实验组能检测到荧光，说明两个蛋白能够互作，反之说明两个蛋白不能互作；

5、“YN173-A + YC155”和“YN173 + YC155-B”为单分子对照组，同阴性对照不会检测到荧光。

6、由于融合表达蛋白空间构象的问题，有时在没有检测到互作的情况下，调换两个蛋白的BiFC载体重新验证，又能够检测到互作。

动物BiFC-常规在293T细胞中验证：

 

04、常见问题与风险提示

1. BiFC能判断蛋白之间互作强度吗？

不能，BiFC的荧光强度主要与蛋白表达量有关，而非互作强度。

2. BiFC实验结果与其他蛋白-蛋白互作实验有冲突？

BiFC实验是通过荧光来判断是否互作，可能会因为蛋白空间结构不合适而无法靠近发出荧光，也可能因为植物自发荧光而干扰到最终结果。出现这种情况，应换其他实验方式再次验证。

3. 实验组无荧光= 蛋白不互作？

不一定。可能的原因：

融合蛋白不表达（建议加做WB检测），蛋白空间构象问题导致无法互补，有时在没有检测到互作的情况下，调换两个蛋白的BiFC载体重新验证，又能够检测到互作。

WB检测注意事项：载体上虽带有HA和MYC标签，但标签较小，可能被荧光蛋白和目的蛋白包在中间，导致WB检测不到，可以提供蛋白特异性抗体进行检测。

 

LCA：高灵敏度验证蛋白互作

01、技术原理

萤光素酶互补实验（LCA）是在BiFC基础上发展出来的一种研究蛋白互作的技术。

将萤光素酶切成N端和C端两个功能片段，并分别与待检测的目标蛋白融合。如果两个目标蛋白有相互作用，则N端片段和C端片段在空间上靠近并互补，从而发挥萤光素酶活性，催化底物产生发光。

简单说：有发光= 有互作，发光越强 = 互作越强（半定量）。

02、实验流程（基于金开瑞服务）

1. 载体构建：蛋白A基因构建到pCAMBIA1300-CLuc载体，蛋白B基因构建到pCAMBIA1300-NLuc载体

2. 烟草转化：将重组质粒转化大肠杆菌扩繁后转化农杆菌，选取生长状态良好的幼嫩烟草叶片进行农杆菌注射

3. 定性观察：植物荧光成像仪观察发光强度并拍照记录表型，也可根据发光强度进行半定量比较

 

03、案例展示

通常将质粒组合分为四组，分别注射到烟草叶片的四个区域：

区域	质粒组合	预期结果
左上（实验组）	A-nLUC + B-cLUC	有发光（若蛋白互作）
其余3组（阴性对照）	空载组合及单分子组合	无发光

注：如果蛋白A与B能够互作，则LUC的n端片段和c端片段也可以互相接近合，恢复酶活性，从而酶解底物发出荧光。

 

04、技术优势

✅ 实时监测：由于荧光素酶催化反应迅速，且生物发光信号强，LCA能够实现实时监测蛋白质互作，无需固定或裂解细胞

✅ 非侵入性检测：在活细胞内进行，不会破坏细胞结构，允许在生理条件下观察蛋白质互作。

✅ 信号强、背景低：提供更真实的生物学环境下的互作信息

缺点提醒

⚠️ 会存在假阳性，需要其他蛋白互作方法（如CoIP、BiFC、GST pull-down）进行进一步验证。

 

三、BiFC vs LCA：一张表看懂怎么选

01、区别

实验方法	双分子荧光互补（BiFC）	荧光素酶蛋白互补（LCA）
应用	1. 蛋白质-蛋白质相互作用	1. 蛋白质相互作用
优点	1. 生物活性状态下原位检测，且可以进行共定位确认互作在哪个细胞结构上发生，分辨率高 2. 可检测弱/瞬时互作	1. 生物活性状态下原位检测，且可以进行相对定量检测互作强度，分辨率低。 2.高灵敏度   3. 可定量
缺点	1. 信号较弱，需优化融合蛋白表达条件（如温度、片段选择） 2. 荧光重构不可逆，可能产生假阳性（片段自发互补） 3. 易假阳性	1. 无法定位互作位置 2. 做定量需裂解细胞，破坏细胞结构 3.可能受酶活性恢复效率影响

 

02、选择建议

你的需求	推荐技术
想知道蛋白互作发生在细胞的哪个位置	BiFC
只需要验证是否互作，对定位要求不高	LCA
需要半定量比较不同互作对的强度	LCA
实验对象是动物细胞	BiFC（293T细胞）

至少需要两种独立的实验方法提供证据，才能得出蛋白相互作用的结论。除了BiFC或LCA外，还应该用不依赖于荧光蛋白不可逆重组的方法对目的蛋白的互作情况进行验证，如CoIP、GST pull down 实验等。

 

四、总结

总的来说，BiFC能够定位蛋白互作发生的细胞位置，LCA则能够半定量评估互作强度。没有最好的方法，只有最适合你科学问题的方法。

但请记住，任何单一实验都有局限性。我们建议：用BiFC锁定位置，用LCA验证强度，最后用Co-IP或GST pull-down给结论加上“双保险”。只有多维度证据链，才能让你的数据经得起推敲。

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