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知无不“研”| 一文读懂 GST pull down（下周二直播预告抢先看！）

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2020-08-17 09:08:45

GST pull down实验原理和流程

利用重组技术将诱饵蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在磁珠上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与诱饵蛋白有相互作用的蛋白与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

证明2种已知蛋白间可能存在的相互作用通常采用GST pull down+WB；寻找与已知蛋白发生相互作用的未知蛋白通常采用GST+MS。

蛋白表达预测常用网站

1、蛋白表达之---跨膜区预测http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

TMHMM是由丹麦理工大学生物序列分析中心CBS负责维护。TMHMM使用了最先进的复杂的隐马尔可夫模型Hidden Markov Models数学模型来预测跨膜区域。

2、蛋白表达之---无序性分析http://protein.bio.unipd.it/espritz/

Espritz是一种新的Web服务器，用于检测被认为不包含结构成分的蛋白质区域。这种非结构称为蛋白质异常。 Espritz使用基于双向递归神经网络（BRNN）的高效且准确的预测算法。BRNN是基于序列的机器学习算法，已发现对其他结构预测有用。

3、蛋白表达之---信号肽预测http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/

参考案例

案例分享一：Proliferating cell nuclear antigen is protected from degradation by forming a complex with MutT Homolog2.

PCNA通过与MTH2结合形成复合物从而避免被降解（肺癌）

GST-MTH2/GST-PCNA融合蛋白与A549细胞总蛋白共孵育

A：CoIP验证MTH2与PCNA互作

B：GST pull down验证MTH2与PCNA互作

C、D：GST pull down确认互作区域

案例分享二：SET7/9 promotes multiple malignant processes in breast cancer development via RUNX2 activation and is negatively regulated by TRIM21S

ET7/9通过RUNX2的激活促进乳腺癌发生的多个恶性过程，并被TRIM21负调控

C：CoIP实验，4株细胞（乳腺癌细胞和正常乳腺细胞），正向和反向验证。

D：SET7/9蛋白全长和截短表达确认互作区域

案例分享三：PRMT5-dependent transcriptional repression of c-Myc target genes promotes gastric cancer progression

c-Myc依赖PRMT5抑制其靶基因转录促进胃癌发展

A：IF检测c-Myc与PRMT5共定位

B：CoIP验证c-Myc与PRMT5互作

C：GST pull down验证c-Myc与PRMT5互作

D：GST pull down确认互作区域

E：通过缺失突变进一步确认互作区域

F：通过定点突变进一步确认互作位点

下周二直播安排抢先看

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