分子互作 | 蛋白-蛋白互作专题之GST pull-down

信息来源:金开瑞 作者:genecreate 发布时间:2023-08-01 10:43:13

一、GST pull down 实验简介

    GST pull down是常用的蛋白与蛋白互作实验方法,利用带有标签的已知蛋白作为诱饵蛋白(最常用的是GST标签,即谷胱甘肽巯基转移酶,glutathione S-transferase),诱饵蛋白特异性结合谷胱甘肽亲和树脂,当目的蛋白溶液过柱时,将诱饵蛋白及其相互作用的蛋白复合物捕获。复合物洗脱后,通过蛋白凝胶电泳分析两种蛋白间的相互作用,或者筛选相应的目的蛋白。

 

二、应用背景

    通过蛋白-蛋白互作的研究技术GST pull down这个实验,研究人员能够探究蛋白质之间的相互作用,揭示细胞内复杂的信号传递和调控网络。这不仅有助于我们对疾病发生机制的理解,还为药物研发和治疗策略的开发提供了重要的参考。

 

三、GST pull down原理简介

 

四、pull down实验流程

(1)蛋白提取与蛋白浓度测定;

(2)pull down前WB检测诱饵蛋白及猎物蛋白的表达;

(3)pull down实验,包括以下步骤

    a.磁珠准备,将磁珠分装且标记为实验组和对照组,用预冷的IP洗涤液重悬磁珠;

    b.磁珠结合诱饵蛋白GST-A(实验组加诱饵蛋白GST-A,对照组加标签GST蛋白),静音混合2h后用预冷的IP洗涤液进行洗涤重悬磁珠;

    c.诱饵蛋白结合互作蛋白His-B(实验组合对照组分别加入His-B或总蛋白),4℃静音混合过夜(约16h)后用预冷的IP洗涤液进行洗涤重悬磁珠;

    d.洗脱;

(4)pull down后WB检测或者MS检测。

 

五、样品类型

1、两个已知蛋白的互作验证

    两个重组表达蛋白需带不同标签,至少有一个带GST或HIS标签,重组蛋白≥200ug,蛋白浓度0.1mg/ml以上,纯度≥85%,上清表达为宜,包涵体表达需做挂柱测试。

 

2、已知蛋白筛选互作蛋白

    ①重组表达蛋白,带GST或HIS标签(重组蛋白≥200ug,蛋白浓度0.1mg/ml以上,纯度≥85%,上清表达为宜,包涵体表达需做挂柱测试)

    ②总蛋白(提供细胞沉淀或新鲜动植物组织)

 

六、应用延伸

GST pull-down实验的诱饵蛋白除了可以带GST标签外,还可以带HiS标签,则称HiS pull-down实验,也有使用多肽或者化合物进行pull down实验,称为多肽pull-down或者化合物pull-down实验。

 

七、实验常见问题

1、IP、Co-IP、pull-down的区别?

    通常IP或coIP使用组织细胞材料,靶蛋白为内源天然蛋白或组织细胞中过表达蛋白(可融合标签)。Pull-down中的诱饵蛋白一般经重组表达获得。IP和coIP需要使用亲和力好的一抗,选购时需注意相应验证数据。

简单来说,IP捕获目的蛋白,Co-IP捕获目的蛋白和其互作蛋白,pull-down用融合标签的重组蛋白来捕获其互作蛋白。

2、如何区分蛋白表达在上清还是包涵体?

    蛋白有可能表达在上清也可能表达在包涵体中,超声碎菌之后,如果菌液比较清亮,沉淀比较少,那表达的蛋白基本是可溶的;如果超声之后,菌液是浑浊的,而且在离心后沉淀比较多,且沉淀的颜色也比较白,蛋白基本就是在表达在包涵体中了。

3、如果蛋白表达在包涵体中是否可以进行后续GST pull down实验?

    包涵体,就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的,用高浓度的尿素和盐酸胍可以使其变性,解聚后再尝试。

 

八、案例分享

Mitophagy associated self-degradation of phosphorylated MAP4 guarantees the migration and proliferation responses of keratinocytes to hypoxia

期刊:cell death discovery

IF:7.109

发表时间:2023/5/17(文章中材料和方法提到金开瑞)

C The direct interaction of GST-LC3 and HIS-MAP4-1 (1–170 aa) measured by GST pull-down. n = 3. D The direct interaction of GST-LC3 and HISMAP4-2 (398–547 aa) detected by GST pull-down. n = 3. E, F The direct interaction of GST-LC3 with MAP4-1 Mut1△34,37 or MAP4-1 Mut2△47,50

detected by GST pull-down. n = 3.




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