实验心得：免疫共沉淀的步骤
信息来源：金开瑞 作者：genecreate 发布时间：2017-09-13 17:30:40
免疫共沉淀（co-IP）的具体步骤：
1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次，最后洗涤完成后吸干PBS液。
2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。
3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入1.5mlEP管中，EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min。
4. 4℃，14000g离心15min。
5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。
6. 准备Protein A琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。
*为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。
7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃10min。
*目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。
8. 4℃，14000g 离心15min，将上清转移到一个新的离心管中。
9. 测定蛋白浓度，可选用Bradford法做蛋白标准曲线。
10. 蛋白定量，分装，-20℃保存，可保存1个月。
11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。
12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。
13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。
14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。
15. 14000rpm瞬时离心5s，去上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。
16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。
17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。
18. 将上样样品煮5min。
19. 14000g离心，收集剩余琼脂糖珠。
20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min变性。
21. 上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳。
基础成分
（1）Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分）
（2）NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分）
（3）NP-40（用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂，用于提取蛋白）
（4）去氧胆酸钠（用H2O配置成10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存）
*因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠。
1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次，最后洗涤完成后吸干PBS液。
2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。
3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入1.5mlEP管中，EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min。
4. 4℃，14000g离心15min。
5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。
6. 准备Protein A琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。
*为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。
7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃10min。
*目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。
8. 4℃，14000g 离心15min，将上清转移到一个新的离心管中。
9. 测定蛋白浓度，可选用Bradford法做蛋白标准曲线。
10. 蛋白定量，分装，-20℃保存，可保存1个月。
11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。
12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。
13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。
14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。
15. 14000rpm瞬时离心5s，去上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。
16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。
17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。
18. 将上样样品煮5min。
19. 14000g离心，收集剩余琼脂糖珠。
20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min变性。
21. 上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳。
基础成分
（1）Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分）
（2）NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分）
（3）NP-40（用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂，用于提取蛋白）
（4）去氧胆酸钠（用H2O配置成10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存）
*因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠。
上一条：抗体纯化方法有哪些？
下一条：什么是抗体片段和抗体片段化
最新动态
-
04.22
一文读懂EMSA技术核心要点，让“emsa” 秒变“easy”
-
04.02
4·2世界孤独症日 | 聆听“星”声“泌”语，让爱来，让碍走
-
04.01
酵母杂交核心技术：深度Q&A帮你轻松突破实验瓶颈
-
03.19
【客户文献解读，IF＞11】食管癌的"隐形推手"：MALR-ILF3-HIF1a轴的强大作用
-
03.18
siRNA介绍及药物研发的现状前景
-
03.18
知无不“研”|5篇高分文献带你一览高通量酵母杂交的非凡魅力~
-
02.27
【客户文章分享】SHMT2 通过 5′UTR 依赖性 ADAM10 翻译启动介导小分子诱导的阿尔茨海默病病理学缓解过程
-
01.24
客户文献解读 | 中医为什么能治流感？是玄学还是运气？INT J NANOMED揭示鱼腥草抗病毒机制及范围！
-
01.24
客户文献分享，IF＞11|Shank3：脑缺血再灌注损伤的守护者，揭示神经保护的新篇章
-
12.27
文献解读 | 高密度脂蛋白通过miR-181a-5p调控自噬影响血管新生
X 
