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多克隆抗体制备流程

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2018-04-10 15:39:16

抗血清，通常指人工被动免疫后所制成的多克隆抗体，它是免疫化学的主要内容。抗血清也成为免疫血清，主要有免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清的分离、抗血清的分析和鉴定。

一、免疫原的制备

免疫原，是人工将抗原制成能刺激机体引起体液或细胞免疫的反应物质。免疫原由质量好的抗原和佐剂制成。常用佐剂弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂。

完全佐剂的具体制法：取羊毛脂：石蜡油1:3比例混合高压灭菌，每毫升加入1.5mg卡介苗制成，使用时同抗原1:1等体积混合，乳化为油包水状态。

不完全佐剂为完全佐剂去除卡介苗制成。

二、动物免疫

常用于动物免疫的动物有家兔（新西兰大耳白、日本大耳白等）、羊（波尔山羊），豚鼠等，其中家兔对抗原的免疫反应性好、个体大小合适等优点使用最多，兔的IGG不分亚类，实验中易于管理。用于免疫的动物要求适龄、健壮、无感染性疾病，雄性最好。

免疫部位：多采用脚掌，腹股沟淋巴结、大腿肌肉，皮下等，采用多部位配合免疫效果好。

免疫剂量根据免疫动物、抗原分子大小，免疫方案不同有较大的区别。根据抗原量不同，可分为微量，常量及大量免疫法。微量免疫抗原在微克级别；常量免疫抗原量在1-10mg左右；大量免疫抗原免疫剂量在50-100mg；小鼠在微克级别，兔子在1毫克到几毫克间。

三、微量采血、效价检测

免疫动物最好先用5-10mg的卡介苗刺激动物，激发免疫系统，通常称为基础免疫，7-10天可起到作用。接着注射第一针，产生初次抗体，IgM型抗体较多；2-4周注射第二针，免疫3-5次后微量采血检测效价，微量采血再免疫后7-10天采集。兔子采用耳缘静脉或动脉，羊可耳缘静脉也可颈静脉采血。

兔子采血：冬季血液流动缓慢，用双手揉搓兔子耳朵，待耳中间动脉血管鼓起，用针头轻轻刺破动脉（注意，不要擦拭酒精或其他液体），这时血液呈滴状流出，用EP管接住即可。夏季由于血液流动活跃，可采用静脉取血。

羊：用剪刀或者电动推子将耳朵上的毛剃光，揉搓耳朵，待血管鼓起，用注射器抽取。

检测效价的方法：简洁ELISA、免疫扩散、单向扩散。或者根据制备抗体的目的选择其他检测、分析方法。

四、免疫血清的采集

微量采血检测达到预期目的后，一次性放血处死。

兔子、豚鼠采用心脏采血、羊采用静脉放血处死。

豚鼠采血5-10ml'，兔子100ml左右，羊，2500ml左右。小鼠用摘取眼球放血。

血液，采血时注意无菌操作，采集后放入面积较大的无菌容器中，先室温凝固30min，再放入37度温箱凝固，最后放入4度冰箱充分凝固。完全凝固后，采用3000-5000rpm离心20min得到透明血清。