DNA测序基本原理及流程

信息来源:金开瑞 作者:genecreate 发布时间:2022-11-01 11:19:45

1977年,Sanger等人发展建立起来的一种DNA测序方法。
 
基本原理:
1.双脱氧链末端终止法
        双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),将延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四组,每组按一定比例加入一种 (ddNTP),它能随机渗入合成的DNA链,一旦渗入合成即终止,于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸,可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。
双脱氧链末端终止法测序基本原理示意
 
双脱氧链末端终止法特点
        双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的优点,而且更适用于大规模的测序。但它要求有一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特异性的引物。因此,早期的工作仅局限于单链噬菌体为模板,若干个不同的特定限制性内切酶酶解片段为引物,在模板链的不同部位引导合成,从而确定出噬菌体DNA的核酸序列。然而,对于大量存在着的天然双链DNA分子,因没有良好的制备产量和质量高的分离链的技术,而限制了双脱氧链末端终止法的应用程度。
 
经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进
        标记物方面的改进: 由于放射性同位素对人体的危害,许多实验室开始利用非放射性物质来取代放射性同位素。如生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物 。在双脱氧法测序时,它们作为标记物,示踪测序反应的产物,最后通过酶显色反应或者荧光信号显示出测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素方法检测容易、安全、快速、费用也低。
 
经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进
         电泳方法的改进: 电泳方法的改进主要采用毛细管电泳法。 毛细管电泳是被分离物质在毛细管中的电泳。1992年,Matnies等首先提出陈列毛细管电泳法,采用激光聚焦荧光扫描检测装置。25只毛细管并列电泳,每只毛细管在1.5小时内可读出350bp。DNA序列分析效率可达6000bp/h 。
 
2.测序过程: DNA Sequencing with GenomeLab TM
1.分离纯化模板DNA*
2.DNA模板定量分析*
3.测序反应*
4.测序反应后纯化* *
5.On-line变性*
6.毛细管电泳和检测*
7.数据分析*
 
分离纯化模板DNA
• 1) 应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到相应的质粒模板或者PCR产物;
• 2) 将DNA储存在灭菌水里如ddH2O, 18.2MΩH2O超纯水;
注意:不要使用 DEPC 处理的水,水中不能有EDTA ,否则将抑制测序反应
• 3) 通过紫外分光光度计定量DNA模板,DNA模板的浓度应该> 0.1ug/ul;
• 4) 通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA模板的质量。
 
测序反应后纯化
去掉反应产物中的dNTP,ddNTP 和盐分
•  乙醇沉淀 ( 利用96 孔板离心机)
测序反应后纯化
纯化得到 DNA测序反应产物
DNA测序仪检测
荧光标记的DNA链按从小到大的顺序被毛细管电泳分离。

激光诱导的荧光终止剂被检测器识别,直接阅读DNA的核苷酸序列
 
Typical Sequencing Result
 
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