首页集团概况技术专题

免疫沉淀（IP）常见问题解答

信息来源：金开瑞作者：genecreate 发布时间：2018-12-28 09:36:04

刚开始做免疫沉淀（IP）的时候肯定会出现各种状况，遇到很多问题，下面我们整理了IP常出现的问题，并附上了解决方案。

首先，当然是做出来的背景很高，可能存在的原因有如下：

1．洗涤不够充分

解决方案:在加入洗涤剂洗涤的时候，应当盖上管盖反复颠倒数次，动作应当轻柔，但次数要有保证，接着在放到离心机里离心。

2．去垢剂不溶性蛋白残留

解决方案：加入上样缓存液，煮5分钟左右，而后离心，吸取上清进行WB

3．非特异性蛋白和珠子产生结合

解决方案：珠子应用BSA充分预封闭，确保BSA新鲜。具体方法为，新鲜琼脂糖珠玉1%BSA（PBS溶解）孵育1h，使用前再用PBS洗涤3-4次。

4．抗体特异性不够

解决方案：使用可以做IP的抗体，阅读文献购买适合做IP的抗体，根据文献报道的加入抗体的量进行IP。

5．抗体过多引起非特异性结合

解决方案：一般目的蛋白直接的binding比较稳固时，减少抗体的使用量，具体可以参考直接的推文。

6．蛋白样品中蛋白浓度过高（尤其是在细胞系上转染过表达两种蛋白质）

解决方案：用裂解液适当地稀释蛋白样品，或者可以选择目的蛋白有表达的细胞系，不做转染，直接收蛋白做IP。

7．IP过程中抗原降解

在裂解液中一定要加入适当的蛋白酶抑制剂，尤其是对于含多个基团（如糖基化）的蛋白，更应当注意在冰上操作和4度离心。

相反，大家可能还会遇到一个问题，那就是没有检测到目的蛋白，原因如下：

1．用的细胞或者组织样品中本身不表达或者低表达这个蛋白，可以换一种该蛋白高表达的细胞系或者组织，重新进行IP

2．抗体量加的太少，导致不能结合到更多的抗原，应当增加抗体浓度。

3．目的蛋白没有从珠子上洗脱下来，此时，首先应确定洗脱缓冲液的质量是否良好，另外可以尝试其他的洗涤剂。

4．抗体没有结合到珠子上，此时，应当确保使用的珠子与抗体亚型是一致的。

5．细胞或组织没有裂解完全，或者完全没有裂解。此时，应当检查裂解液是否已经失效，可以重新配置，再进行IP。