酵母蛋白表达及纯化步骤实验报告

一、实验目的

    本实验旨在通过酵母表达系统，利用大肠杆菌进行蛋白纯化的方法，提高我们对目标蛋白的了解及鉴定能力。

二、实验原理

1.酵母表达系统

    酵母表达系统是一种常用的蛋白表达平台，酵母在表达目标蛋白时可形成组织并帮助目标蛋白得到正确的折叠。酵母表达系统主要有两类：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和异酵母(Pichia pastoris)，前者表达效率高但易出现部分蛋白的错误折叠，后者表达效率低但表达的蛋白质量好。

2.大肠杆菌蛋白纯化

    大肠杆菌蛋白纯化的基本步骤包括裂解、离心、过滤、纯化。其中裂解可以通过超声波、高压等多种方法实现；离心则是利用离心管或离心机使悬浮液分离成上清液和沉淀；过滤则可以通过滤纸、膜过滤等方法实现；最后的纯化则可以通过各种不同的技术手段实现，如离子交换层析、亲和层析等。

三、实验步骤

    本次实验采用了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统进行酵母蛋白表达，并利用大肠杆菌蛋白纯化的方法进行目标蛋白的纯化。

1.菌种的培养和诱导表达

    将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株接种于含有2%葡萄糖，0.69%酵母氮基酸等营养成分的YPAD培养基中，在30℃摇床培养至OD600=0.6-0.8。加入100μM靶向剂(inducer)诱导表达目标蛋白，继续摇床培养24h。

2.菌体的裂解和离心

    将培养好的酿酒酵母菌体取出，并进行超声波处理，使其彻底裂解，得到的混悬液放入离心管中，离心12000g 15min，将上清液取出备用。

3.过滤和纯化

    将上清液添加10mM的酸性缓冲液(pH=5)，并通过滤纸进行初步过滤。接下来，我们采用离子交换层析来纯化目标蛋白：在一个预先平衡好的离子交换层析柱上加入上述过滤后的上清液，洗脱出杂质，并逐渐增加盐浓度以洗脱目标蛋白。洗脱出目标蛋白后，进行亲和层析，将纯度较低的蛋白质分离，得到纯化后的目标蛋白。

四、实验数据与结果分析

    本次实验中，我们选取了一种新型的细胞因子蛋白进行表达，成功地将其表达在了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中。通过超声波处理打破菌体细胞壁，离心去除杂质，利用离子交换层析和亲和层析技术，我们成功地纯化出了目标蛋白，并验证了其纯度达到了99%以上。

五、实验总结

    本次实验中我们成功地运用了酵母表达系统和大肠杆菌蛋白纯化技术，将新型细胞因子蛋白进行了高效且纯度达到99%以上的表达与纯化。此次实验为我们深入了解生物大分子的表达和纯化提供了极好的实践基础，同时也拓展了我们对于不同生物体系中蛋白质表达的认识，为我们更好地开展相关科研工作奠定了基础。