拉不下来先别换抗体：把Co-IP拆成13道能判的故障

1、把「拉不下来」拆成可判定的失败模式：Input × IP 四象限与排查优先级

拿到一张 IP 泳道干净得可疑的膜，第一反应不该是换抗体。这事儿吧，多数人把「拉不下来」当成一个整体问题，抗体换了三株、裂解液配了四版，钱花完了故障还站在最开始那一格。能定位的前提是把结果拆成两个独立观测：Input 里目的蛋白在不在，IP 泳道里共沉淀信号在不在。两个布尔量一交叉就是四个象限，每格对应的排查方向完全不同，有的格子压根不该动抗体，有的格子动了抗体等于白动。

先把两个观测放在同一张膜上

Input 取总裂解液的 2%–5%（约 10–50 µg 总蛋白），与 IP 泳道同胶、同膜、同曝光。第一条纪律是 Input 不能进饱和：16-bit 化学发光到 65535 灰度就压顶，饱和会把强表达误读成弱表达，四象限从根上就歪；看到发白发糊先按 1:5、1:10 稀释重跑。第二条纪律是对照泳道必须同批裂解液、等量微珠、同样洗涤程序，否则比较的是不同实验。

图 1｜Input × IP 四象限与「首个排查动作」。四个格子不是四种失败，而是四种判读前提：左上才是真正的沉淀链路故障，左下与抗体无关，右下要先证伪而不是报阳性。青色文字只写第一个动作，因为排查一旦跳步，后面所有条件优化都建立在错误前提上。

四象限各自的首个动作

表 1｜四象限失败模式、判读逻辑与首个动作（数值为典型量级示例）

象限	失败模式	判读逻辑	首个动作
Input＋ / IP−	目的蛋白在样本里，沉淀不下来	样本层无问题，故障落在表位、裂解、微珠、洗脱链路	核对抗体是否 IP-grade、天然构象表位；再去垢剂梯度 0.1%→1%
Input＋ / IP＋	有共沉淀带，可能混着非特异	回收率过关，特异性未过关	补齐 IgG / Beads only / 阳性对照，算富集倍数是否 ≥ 3–5
Input− / IP−	目的蛋白本底就查不到	与沉淀体系无关，换抗体没有意义	查表达量、上样 10–50 µg、不溶沉淀、冻融降解、检测一抗
Input− / IP＋	Input 没有、IP 反倒有带	假阳性高发：IgG、珠吸附、二抗交叉、串道、曝光过度	核对曝光线性与整膜，换 4–12% 梯度胶，重跑全部对照

说白了，四象限里只有左上角那格才配叫「拉不下来」。另外三格要么在样本制备层，要么在对照与呈现层，硬往抗体上归因就是南辕北辙。排查顺序也就定死：先看 Input 有没有且没饱和，再跑 IgG 与 Beads only 两条对照，确认体系没在自说自话，然后才进抗体、裂解液、微珠这些参数。这个顺序的价值在于每步都能证伪前一步——Input 阴性时，后面所有优化都是在给一个不存在的信号打工。

别跳步的三条纪律

• 一次只动一个变量：浓度、去垢剂、盐、时长同时改，变好也说不清是谁的功劳。
• 留全记录：细胞数、裂解体积、蛋白定量、珠量、抗体批号、洗脱体积逐项写表。
• 阳性对照先行：全盘阴性时没它，分不清是体系还是样本问题。

Input 与 IP 的「有/无」必须同一曝光比较；单独拉长 IP 曝光会人为造出诡异象限，这类技术性假象先排除。

2、抗体关：IP-grade 验证、天然构象表位 vs 线性表位、单抗多抗与用量梯度

别急着换抗体，先问一句：手里这株是拿什么条件筛出来的。WB 好用只说明它认还原变性后、转膜上那条线性表位；IP 要在天然折叠状态下抓住活蛋白，靠的是构象表位——一级序列上不相邻的几个残基，折叠后才在空间上拼成一个面。两件事压根不是同一道题。一株针对 C 端短肽免疫的 WB 抗体，表位在天然蛋白里可能整个埋在疏水核心，溶液里根本够不着；反过来 IP-grade 抗体识别天然构象，煮样变性后 WB 又可能不认。所以常见配置是 IP 与 WB 用不同克隆、甚至不同种属，而不是一支抗体从头打到尾。

构象表位差异怎么落到判读上

拿到一株只标了 WB 的抗体，判定它能不能 IP 的成本很低：拿已知阳性裂解液做一次小规模沉淀，看 IP 泳道有没有货，再拿同一株做 WB 检测。若 IP 空白而 WB 很亮，八成是表位在天然态不可及。这事儿吧，厂商的「IP-grade」标签本质就是替你做过这一步验证，且通常在非变性裂解液里测过回收率，不是加了个形容词。另有一个隐蔽的坑：交联固定、变性洗脱、或裂解液里加了 0.1% SDS，都会把构象表位抹掉，此时 IP-grade 抗体一样失效。判读顺序是先确认裂解条件没把表位拆了，再怀疑抗体本身。

表 2｜抗体相关故障—原因—动作对照（数值为典型量级示例）

现象	最可能原因	量化判据	动作
Input 亮、IP 空白	WB 线性表位在天然态不可及	小规模 IP 回收率 < 5%	换 IP-grade 克隆，或 IP / WB 分用两株
IP 与 IgG 都亮	抗体过量、非特异共带	> 10 µg / mg 总蛋白	做 1 / 2 / 5 / 10 µg 梯度，降到平台起点
批次间结果漂移	多抗批次差异	同一样本富集倍数差 > 2 倍	锁定批号、一次性分装，换单抗
加交联剂后全丢	表位被交联或变性掩盖	回收率掉 > 50%	降交联剂浓度、改竞争肽温和洗脱

单抗多抗与用量梯度

单抗表位单一、批次一致，但表位一旦被互作界面、交联或标签遮蔽就全盘皆输；多抗多表位容错高、耐轻微构象变化，代价是批次漂移、背景偏高，跨批号比较富集倍数等于没比。用量按 1–10 µg 抗体 / mg 总蛋白起步（常见 2–5 µg，或按厂家 1:50–1:200），做 1、2、5、10 µg 四档梯度。判读看的不是绝对条带亮度，而是 IP 信号 / IgG 背景 的比值：游离抗体过量时会抢占微珠上有限的 A/G 位点、把特异性稀释掉，10 µg 档常常条带最亮却比值最差。最适剂量通常落在信号刚进入平台的那一档，而不是最高档。

口语提示很多「拉不下来」其实是抗体加太多、背景糊成一片。老实讲，先把抗体量砍一半、把 IgG 对照摆齐，往往比换新抗体管用；新抗体还得重新验表位。

常见失败：WB 稀释倍数直接当 IP 用，浓度差一个量级；IP 与 WB 同株兔抗则 50 kDa 附近被二抗糊住，见第 10 节。

3、种属与亚型搭配：Protein A/G 亲和力差异、同源二抗重链干扰、交叉吸附二抗

抗体能不能被珠子抓住，取决于它的种属和亚型，跟它认不认抗原没关系。Protein A 对兔 IgG、人 IgG1/2/4、小鼠 IgG2a/2b 结合强，对小鼠 IgG1、大鼠、山羊、鸡 IgY 就明显偏弱；Protein G 覆盖面宽得多，小鼠 IgG1、大鼠 IgG、人 IgG3 都吃，但对 IgM、IgA、IgE、鸡 IgY 基本不结合。现在的 A/G 融合蛋白把两者谱系拼起来，成了默认选项。挺容易翻车的就在这儿：拿着一株小鼠 IgG1 单抗，配了纯 Protein A 珠，抗体挂不上去，后面再怎么优化裂解液都是白搭。

亲和力与洗脱条件是耦合的

A/G 与 IgG 的亲和力在 nM 量级，常温结合很快，4℃ 30–60 min 基本饱和。但酸性洗脱是这套体系的软肋：0.1 M 甘氨酸 pH 2.5–3.0 会把 A/G–IgG 一起拆开，抗体共洗脱进样品，既污染后续 WB 条带，也给质谱塞满 IgG 肽段。若打算做 Co-IP-MS，要么把抗体共价交联到珠上（见第 10 节），要么改走标签竞争洗脱。判读逻辑是：先按一抗亚型选 A 还是 G 还是 A/G，再倒推洗脱方式，别等洗脱完了才发现抗体全在样品里。

一抗二抗同源，重链干扰从这里埋下

IP 用兔抗、WB 也用兔抗加抗兔二抗，洗脱液里那 1–5 µg IgG 就会在还原上样后变成重链 50 kDa、轻链 25 kDa 两条强带，二抗照样认。目的蛋白若恰好落在 45–55 kDa 或 23–28 kDa，直接被盖住，判读当场塌掉。三条绕开的路线：换种属，IP 用鼠抗、WB 用兔抗（或反过来），二抗只认后者；换二抗，用交叉吸附二抗或构象特异二抗（VeriBlot / Clean-Blot / TrueBlot 一类），只识别非还原态 IgG、避开变性重轻链；直接标记，把 IP 一抗偶联 HRP 或生物素，WB 阶段不再上二抗。代价分别是多买一株抗体、灵敏度略降且贵、以及偶联可能折损效价。

• 兔多抗：A / G / A-G 都行，最省心，但重链干扰概率最高。
• 小鼠 IgG1 单抗：优先 Protein G 或 A/G，纯 A 珠容易挂不上。
• 大鼠、山羊、鸡 IgY：别想当然用 A/G，先查厂家亲和力表，必要时用针对该种属的二抗包被珠。

开工前把一抗种属/亚型、目的蛋白 kDa、检测二抗种属三行并列核对，能提前堵掉第 10 节一半的坑。

4、裂解液配方：NP-40 / Triton / 洋地黄皂苷 / RIPA 强弱谱、盐、pH、Mg²⁺ 与抑制剂现配

裂解液是整条链路里最容易被顺手搞砸的一环。去垢剂按对蛋白互作的破坏力排成一条谱：洋地黄皂苷 0.05–0.2% 最温和，选择性透化质膜、保得住膜蛋白与细胞器互作；NP-40（IGEPAL CA-630）0.1%–1%、常用 0.5%，是 Co-IP 的默认起点；Triton X-100 同浓度档但略强；到 RIPA（1% NP-40 + 0.5% 脱氧胆酸钠 + 0.1% SDS）就已经是拆互作的配方了，那 0.1% SDS 足以把多数弱互作拆散。老实讲，很多「拉不下来」只是因为图省事直接用了平时配 WB 样品的 RIPA。

浓度要滴定，不要抄一个配方

NP-40 / Triton 做 0.1%、0.25%、0.5%、1.0% 四档梯度，每档都跑一次 IP 加 IgG 对照，看互作信号与背景的交叉点：浓度太低裂解不完全、目的蛋白留在不溶沉淀里，太高则互作被拆、背景反而因膜脂溶出变复杂。盐从 100–150 mM NaCl 起，升到 250–300 mM 能压掉静电型非特异吸附，但超过 300 mM 连静电驱动的弱互作也一起拆；KCl 有时比 NaCl 温和。缓冲用 Tris-HCl 20–50 mM、pH 7.2–7.5，Mg²⁺ 1–5 mM 保住依赖 Mg/ATP 的复合物，EDTA 1–5 mM 会把 Mg²⁺ 螯合走，磷酸化依赖的互作还得现加 NaF 10–20 mM、β-甘油磷酸 10–50 mM、Na₃VO₄ 0.1–1 mM。

表 3｜去垢剂与缓冲条件强弱谱（数值为典型量级示例）

条件	常用量级	判读与失败模式
洋地黄皂苷	0.05–0.2%	最温和，膜蛋白互作首选；裂解偏弱，目的蛋白易留 pellet
NP-40 / Triton	0.1–1%（常用 0.5%）	默认起点，按 0.1→1% 梯度找信号与背景交叉点
RIPA	1% NP-40 + 0.5% DOC + 0.1% SDS	强；0.1% SDS 拆多数弱互作，Co-IP 慎用
NaCl	100–150 mM 起，250–300 mM 压背景	超过 300 mM 连弱互作一起拆，别一步到 500 mM
pH / Mg²⁺ / 抑制剂	pH 7.2–7.5；Mg²⁺ 1–5 mM；抑制剂现配	PMSF 水相半衰期仅 30–60 min，母液反复冻融等于没加

图 2｜复合物结合层级与两条孵育路线。抗体经 Fc 定向挂在 A/G 上、Fab 朝外抓天然构象表位；路线 A 博回收率、路线 B 博洁净度，代价相反。对应第 3、4、7 节。

抑制剂一律现配现用、全程 4℃：PMSF 水相半衰期只有 30–60 min。失败模式很固定——裂解液搁了一周、母液冻融五次，目的蛋白被降解却按「拉不下来」去换抗体。

5、裂解副产物：核酸黏度、超声条件、不溶组分、冻融次数与样本量归一化

裂解液吸头一拉丝，就是基因组 DNA 释放的信号，别硬着头皮往下做。黏度会抬非特异吸附、让磁珠团聚、让电泳迁移变形。处理两条路：冰上超声 3–5 次 × 10 s、间隔 10 s、振幅 20–30%，或加 Benzonase 25–50 U/mL 配 Mg²⁺ 2 mM、4℃ 15–30 min 消化核酸；超声过头会产热、把复合物震散，宁可少几次多歇一会儿。随后 4℃、12000–16000 ×g 离心 10–20 min 取上清，这一步的沉淀别丢，单独取样跑 WB，判断目的蛋白是不是根本没被裂解出来。

不溶组分与冻融是两笔隐形账

膜蛋白、核蛋白、骨架结合蛋白常常整批留在 pellet 里，上清看着澄清，其实靶标全在沉淀——这时再怎么调抗体都没用，该回去加去垢剂强度或换洋地黄皂苷。裂解液尽量现用，冻融次数控制在 1–2 次以内，反复冻融既降解蛋白又让复合物解离；要留样就按 50–100 µL 分装、液氮速冻后存 −80℃，别整管反复化冻。样本量也要归一：每 IP 约 1×10⁶–1×10⁷ 细胞或组织 20–50 mg、裂解体积 0.5–1 mL，用 BCA / Bradford 把每组 Input 总蛋白拉平（如 1 mg / IP），再用 Input WB 归一化目的蛋白表达量，否则「IP 信号变弱」可能只是上样量差了三成。

• 黏度：拉丝即处理，超声或核酸酶二选一，记录次数与振幅。
• pellet：留样跑 WB，确认目的蛋白没被丢在不溶组分。
• 冻融：≤ 1–2 次，分装速冻，记录管号与化冻次数。
• 归一化：总蛋白与目的蛋白表达量两条都要拉平，再比 IP 富集。

黏度、pellet、冻融三项都留痕，否则样本层差异会伪装成体系差异。

6、微珠体系：琼脂糖 vs 磁珠、BSA / 鲑精 DNA 封闭、预清除与非特异吸附量化

珠子不是中立载体，它决定回收率、背景和操作节奏。琼脂糖珠直径约 45–165 µm、多孔、比表面积大、载量高，但每次洗涤都要 1000–3000 ×g 离心 1–3 min，沉降慢、容易吸走珠、死体积 10–20 µL，残留上清稀释洗脱液，背景天然偏高。磁珠直径 1–5 µm（常见 1 µm 与 2.8 µm），表面结合、扩散快，磁力架 10–30 s 就澄清、不用离心、死体积约 5 µL、背景低，适合自动化和少量珍贵样本；代价是载量只有 10–40 µg IgG / mg 珠、成本高，且高盐或去垢剂下易团聚。

选择逻辑与封闭、预清除

取舍其实不绕：样本珍贵、靶标低丰度、要低背景或上质谱，选磁珠；裂解液体积大、要堆载量、预算紧，选琼脂糖。封闭用 3–5% BSA 或 0.5–1% 酪蛋白、4℃ 1 h；做核蛋白或核酸结合蛋白再补鲑精 DNA 0.1–0.5 mg/mL（或 tRNA）封核酸结合位点。预清除是让裂解液先和空白珠 4℃ 转 30–60 min，把爱粘基质的蛋白先带走，代价是顺手损失 5–15% 目的蛋白，弱互作体系要慎用。非特异吸附别靠「有没有杂带」这种感觉，量化成 Beads only 泳道总灰度 / IP 泳道总灰度：超过 10–20% 就说明封闭、预清除或洗涤至少一项要加码。

口语提示说白了，磁珠贵就贵在「省事且干净」，不是「拉得更多」。 beads 在磁力架上别晾超过 1–2 min，干裂结块之后重悬不回来；预清除也别转太久，转过头把目的复合物一起带走了，还以为是珠子不行。

两头都翻车：预清除过头压低回收率，或不做封闭让 Beads only 比 IP 还亮。珠型、珠量、封闭剂、预清除时长都要记，换批号时全是变量。

7、孵育顺序两条路线：抗体先挂珠 vs 先孵样本，对背景与回收率的相反影响

同样的抗体和裂解液，只把「抗体什么时候见珠子」调一下，结果能差一大截。路线 A 抗体先孵样本：抗体加进裂解液 4℃ 转 1–4 h（弱互作可过夜），在溶液里先找到天然构象表位，再加 A/G 珠捕获 30–60 min；回收率高，对低丰度、易被珠面遮蔽的表位友好，代价是游离 IgG 与血清蛋白共带、背景偏高。路线 B 反过来：抗体先与 A/G 珠 4℃ 结合 30–60 min、洗掉未结合抗体，再加裂解液孵 1–2 h，洗脱液抗体少、背景低，Co-IP-MS 基本走这条；代价是珠面位阻，回收率常掉 20–40%。

取向、时长与判读

A/G 是结合 Fc 段的，等于把抗体定向摆成 Fab 朝外，比随机胺偶联的取向可控得多；若用共价偶联磁珠，就得自己盯偶联 pH 和封闭残留。孵育一律 4℃、旋转混匀 10–20 rpm，2 h 是多数互作进入平台的起点，超过 4 h 后特异信号趋于平台而背景近乎线性上升，纯属给自己添堵。判读要同时看两条曲线：IP / IgG 富集倍数 和 回收率。路线 A 博前者未必赢、后者稳赢，路线 B 恰好相反；只报一条带亮度、不报回收率，等于没比较。这事儿吧，选路线先问下游是 WB 定性还是质谱交付，别两边都想要。

失败模式集中在温度和时间：室温久转会让弱互作解离、蛋白酶开工。图 2 下半部分并排画了两条路线的相反代价。

8、洗涤与洗脱：盐梯度、去垢剂强度、洗脱 pH 与竞争肽、变性洗脱的代价

洗涤的目标不是「洗得越干净越好」，而是把背景压下去的同时留住目的信号。常规 3–5 次、每次 5–10 min、4℃、缓冲液 20–50 倍珠体积。严谨度按阶梯走：第 1–2 次用与裂解液同配方（0.1–0.5% NP-40、150 mM NaCl），第 3–4 次把 NaCl 升到 250–500 mM 或加 0.1% 脱氧胆酸钠，最后一次换无去垢剂 / 低盐缓冲液平衡。每次磁力架 10–30 s 或 2000 ×g 离心 1 min，弃上清后拿滤纸把残液蘸干，否则洗脱被稀释、条带发虚。判读逻辑是特异信号随次数缓慢下降、背景信号陡降，两线交叉处就是最优次数；洗到第 5 次以后特异也开始掉，就是过洗，再洗下去压掉的是自己的目的蛋白。

三种洗脱，对应三种下游

酸性洗脱用 0.1 M 甘氨酸 pH 2.5–3.0、室温 5–10 min，回收快且高，但必须立刻按 1:10 体积加 1 M Tris pH 8–9 中和，蛋白在低 pH 里放久了会失活降解；抗体也会一并洗脱，给质谱塞满 IgG 肽段。竞争肽洗脱（3×FLAG / HA / Myc 肽 0.1–0.5 mg/mL、4℃ 30–60 min）最温和、特异最高、洗脱液最干净，是标签 Co-IP-MS 的首选，代价是慢、贵、必须有标签。变性洗脱用 1× SDS 上样缓冲液 95℃ 5 min，回收最彻底，可 IgG 重链轻链全进样品，下游只能做 WB，酶活、再沉淀、质谱全被去垢剂和抗体污染拖死。

• WB 定性：酸性或变性洗脱都行，快、省事。
• 质谱 / 酶活：优先竞争肽，其次交联后酸性洗脱，避开 SDS。
• 弱互作：洗涤阶梯整体下调一档，宁可留点背景也别把互作洗没。

洗涤强度与两类信号的定量关系见图 4：严谨度是换信噪比的，超过交叉点后每多洗一次都在赔本。

9、对照体系：Input / 同型 IgG / Beads only / 阳性 / 互换 IP / 刺激依赖，缺一个塌一角

对照不是凑泳道，是给结论搭承重墙。Input（2–5% 裂解液或 10–50 µg 总蛋白）证明样本里确有目的蛋白、上样量一致、检测抗体还认；同型 IgG 必须同物种、同亚型、与 IP 抗体严格等摩尔（如兔 IgG 5 µg 对兔一抗 5 µg），控制 Fc 与 A/G 珠的非特异结合及内源 IgG 干扰；Beads only 不加抗体、只加等量珠和裂解液，量化珠基质、封闭剂、缓冲液自身的吸附。缺 Input，IP 阴性分不清是没拉下来还是没表达；缺 IgG，条带都能被质疑是 IgG 带下来的；缺 Beads only，连 IgG 还是珠在吸附都说不清。

图 3｜五泳道胶图判读。橙色为目的条带、紫色为 IgG 重链 50 kDa 与轻链 25 kDa；Input / IgG / Beads only / IP / 阳性对照须同膜同曝光。对应第 9、10 节。

剩下三项补的是说服力

阳性对照用一对已知互作，证明整套流程当天没崩，全盘阴性时没它就定位不了是体系还是样本；互换 IP 换成用 B 抗体拉 A、反向再验一次，单向结果的说服力才立得住；刺激依赖互作必须设未刺激、加抑制剂或时间 0 点，否则组成型污染会被当成诱导互作。所有对照泳道与 IP 共用同一批裂解液、同一珠量、同一洗涤程序、同一张膜、同一曝光。判读阈值定死：IP 泳道目的条带扣除本地背景后，相对 IgG 与 Beads only 的富集 ≥ 3–5 倍 才敢写「特异共沉淀」。

• Input：2–5% 或 10–50 µg，且未饱和。
• 同型 IgG：同物种同亚型、等摩尔，别拿不同厂家凑数。
• Beads only：等量珠、不加抗体、同封闭同洗涤。
• 阳性对照 / 互换 IP / 刺激依赖：当天设置，缺一项结论就少一角。

别急着裁那条漂亮带发图：IgG 对照若换了亚型或厂家，等于没对照，审稿人一句就能打回。

10、重链轻链污染：条带判读、构象特异二抗、抗体共价交联、免还原上样与质谱友好策略

还原上样后，洗脱液里那 1–5 µg IgG 会拆成重链约 50 kDa、轻链约 25 kDa 两条强带，非还原时完整 IgG 约 150 kDa 跑在胶顶。目的蛋白若落在 45–55 kDa 或 23–28 kDa，正好被压住。判读第一步是拿 IgG 与 Beads only 泳道对位置：同高度出现就是污染，不是信号；换 8%→10%→12% 胶或 4–12% 梯度胶、缩短曝光，常常能把共迁移拉开。构象特异二抗（VeriBlot / Clean-Blot / TrueBlot 一类）或交叉吸附二抗只认非还原态 IgG、避开变性重轻链，代价是灵敏度略降、单价偏高；更彻底的做法是让 IP 与 WB 用不同种属一抗，从根上不引入同源二抗。

把抗体钉在珠子上

共价交联是 Co-IP-MS 的关键一步：先让抗体结合 A/G 珠，再用 DSS、DMP、BS3 或戊二醛在 pH 7–8、室温 30–60 min 把它固定住，Tris / 甘氨酸淬灭残基，之后酸性洗脱时抗体不再共洗脱，质谱里就不会被 IgG 肽段淹没。代价要认：交联可能伤 Fab、回收率常降 10–30%，浓度必须滴定（BS3 1–5 mM 做三档）。免还原上样是另一条省钱路子——不煮、不加 β-ME / DTT，IgG 保持 150 kDa 跑胶顶，避开 50/25 kDa，但目的蛋白自身迁移位置也会变，得重新认带。质谱友好的组合是：交联 + 竞争肽温和洗脱 + 无去垢剂末次洗涤，洗脱液里别留 SDS 或 NP-40，两者都抑制酶解与离子化。

口语提示交联剂浓度务必自己滴定，别抄邻组配方：BS3 从 5 mM 一路加上去，Fab 被交联失活、回收率掉一半，还容易被误判成珠子坏了。先跑 1、2、5 mM 三档，同时看回收率与 IgG 残留再定，含 SDS 的洗脱液更不能直接进质谱。

失败模式两类：交联过量把抗体做废，或变性洗脱液直接进质谱导致离子抑制。先认出污染，再决定用二抗、种属错配还是交联。

11、弱互作与瞬时互作：可裂解交联剂、原位交联、刺激时间点、邻近标记替代路线

有些互作本来就不是「拉不下来」，而是「洗一次就没」。Kd 落在 µM–mM、解离半衰期以秒计，标准 2 h 孵育加 3–5 次洗涤足够把它清零。判读特征很明确：IP 泳道本来有带，盐浓度一抬或多洗一次就消失，同时 IgG 背景一直很干净——这不是抗体不行，是互作太弱。此时先别急着加严谨度，反过来把洗涤阶梯整体下调一档，宁可留点背景也保住信号，图 4 的决策窗口对这类体系要整体左移。

先把接触固定住，再谈洗

可裂解交联剂是正解：DSP / DTSSP 带二硫键、可被还原剂裂解，DSSO / DSBU 质谱可裂解并带报告离子，甲醛 1% 室温 10 min 可逆但交联谱复杂。用量级上，DSP 0.5–2 mM、冰上或室温 30 min–2 h，20–50 mM Tris 淬灭；甲醛后用 0.125 M 甘氨酸淬灭；DSBU 交联后还能用质谱定位交联肽段。原位（in cellulo）交联再裂解的好处是互作已被共价锁死，之后反而可以用 RIPA 这类强裂解液把背景洗得更干净。刺激依赖的互作另做时间梯度 0 / 2 / 5 / 15 / 30 / 60 min，峰值常在 5–15 min，取样要快、裂解液预冷并补足磷酸酶抑制剂。

• 交联剂：DSP / DTSSP / DSSO / DSBU 按「能否裂解、能否上质谱」选，浓度自己滴定。
• 时间点：至少四个点，别只取单点错过峰值就判无互作。
• 替代路线：BioID 生物素 50 µM 标记 16–24 h、TurboID 10–30 min、APEX2 加 H₂O₂ 1 min。

邻近标记捕获的是半径约 10–20 nm 的「邻居」而非互作，必带旁观者：Co-IP 问同一复合物，它问同一邻域，不能互相顶替。失败模式是交联剂过量假阳性聚集，或只取单点就下结论。

12、标签 Co-IP 与 Co-IP-MS：竞争洗脱、背景蛋白清单与富集打分、重复数与定量

带标签的体系把第 10 节的麻烦绕开不少：FLAG / 3×FLAG、HA、Myc、V5、Strep、GFP 配抗标签磁珠（如 M2 抗 FLAG），用 3×FLAG 肽 0.1–0.5 mg/mL（常用 0.15–0.2 mg/mL）4℃ 竞争洗脱 30 min、洗两次合并，几乎不带内源 IgG，质谱背景最干净，用量按 20–50 µL 珠浆 / 1 mg 总蛋白。取舍也清楚：标签可能干扰折叠、定位或互作界面，必须做功能回补验证（N 端还是 C 端、加 linker）；过表达还会造出非生理互作与化学计量失衡，接近内源水平或做内源敲入更稳。

图 4｜洗涤强度与特异 / 背景双折线。背景前几次陡降、特异缓降，交叉区（第 3–4 次、250–300 mM）即推荐决策区；再往上加严谨度就是过洗。对应第 8、11、12 节。

交付质谱前把背景蛋白认全

先建一份内部黑名单：角蛋白、IgG、血清白蛋白、HSP70 / 90、肌动蛋白、微管蛋白、核糖体蛋白、线粒体蛋白、核酸结合蛋白、蛋白酶体亚基，以及 A/G 珠渗漏的 Protein A/G，都是高频污染物，按对照泳道出现频率打分（CRAPome 思路）。富集判定用 SAINTexpress / BFDR 或谱图计数比、LFQ 强度，IP 相对 IgG 与 Beads only 的 fold enrichment ≥ 3–5 且 BFDR ≤ 0.05 才进候选，只在 IP 出现、对照零检出的优先。重复数要 ≥ 3 次生物学重复而非技术重复，TMT 标记合并或 label-free MaxLFQ / DIA 定量，missing value 与批次随机化都得写进方案；先看对照扣除，再看 fold change，别拿 IP 的绝对强度直接排名字，否则排第一的永远是角蛋白。

失败模式很朴素：把角蛋白、HSP 当新互作蛋白写进结论。质谱对背景的容忍度比 WB 低一个量级，宁可少洗一次也别把弱互作洗丢。

13、结果解释边界与论文级呈现：Co-IP 不能证明直接互作、整膜、曝光线性范围与判定清单

最后一道关是别把结论写过头。Co-IP 证明的是「在同一裂解条件下、同一复合物里被共同沉淀」，不证明两个蛋白直接物理接触——中间可能隔着桥接蛋白、支架蛋白，甚至由核酸牵线。要证直接互作，得换体外纯化蛋白的 pull-down、ITC / SPR、交联质谱定位到的交联肽，或把互作界面突变掉看共沉淀是否消失。措辞上写「共沉淀」「同一复合物」，别写「直接结合」，这一步省不得。

呈现与定量同样能翻车

整膜、未裁剪、标清 marker 位置，Input / IgG / Beads only / IP / 阳性对照全部同框，只裁一条漂亮条带是最容易被质疑的做法。曝光要落在线性范围：16-bit 化学发光到 65535 灰度就饱和，做 1 / 2 / 5 / 10 s 或稀释梯度确认条带没压顶，定量只用未饱和那张。灰度扣除本地背景后按 Input 归一化（IP 条带 / Input 条带 / 上样比），三次生物学重复给均值 ± SD 和统计检验，别用「看起来更亮」当结论。把前面十二节的判据收成一张能照着勾的清单：

1. Input 有目的带且未饱和（2–5% 裂解液或 10–50 µg 总蛋白）。
2. IgG / Beads only 在目的位置无带或显著弱于 IP。
3. IP 相对对照富集 ≥ 3–5 倍，且已扣除本地背景。
4. 阳性对照、互换 IP、刺激依赖对照当天齐全。
5. 重链 50 kDa / 轻链 25 kDa 不共迁移，或已用交联、构象特异二抗排除。
6. 整膜呈现、marker 清晰、曝光处于线性范围（< 65535 灰度）。
7. 至少 3 次生物学重复，灰度以 Input 归一化并给统计检验。
8. 结论措辞不越界：只报共沉淀与同一复合物，不报直接结合。

把「看起来有带」拆成一组能逐条证伪的判据。判据缺一角，再漂亮的条带也只是曝光。