【支招】膜体系酵母双杂载体怎么选？

书接上文，上回我们聊到了酵母杂交自激活现象的产生原因及其应对策略，这期我们来唠一唠膜体系酵母双杂载体怎么选择。

DUAL membrane 系统(DUAL membrane system)首先由瑞士的Dualsystems Biotech AG 公司开发出来，是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统。可介导蛋白降解的泛素(ubiquitin)被分为：

①Cub（C端结构域）

②Nub（N端结构域）：第三位的I被突变为G得到NubG，NubG在bait和prey互作下结构重构，与Cub发生互作

 

膜蛋白酵母双杂交-Dualsystems split ubiquitin原理是：

Cub与LexA-VP16转录激活因子连接成Cub-LexA-VP16，当bait-Cub-LexA-VP16与prey-NubG可互作时，Cub与NubG在空间上接近发生重构，被泛素特异性蛋白酶UBPs识别，LexA-VP16被解离进入核内，使启动子下游基因（抗性筛选、蓝白斑筛选、营养缺陷型筛选等）得到转录。

膜体系酵母双杂选择载体是根据诱饵蛋白质定位的不同来选择，有利于互作蛋白相连的泛素NubG和Cub-LexA-VP16相互作用，被UBPs识别，从而启动下游报告基因表达。主要分为以下几种情况：

1. 若诱饵蛋白的N端在胞质，C端在细胞器腔内（或者胞外），建议用pBT3-N载体构建诱饵。

 

2. 若诱饵蛋白是C端位于胞质，N端位于细胞器腔内（或者胞外），且N端含有信号肽，选择载体pBT3-SUC构建诱饵重组质粒，这是因为某些哺乳动物细胞的信号肽在酵母中无法识别，而pBT3-SUC中含有一段酵素转化酶（SUC2）基因序列，当其定位在诱饵蛋白N端，能够确保诱饵蛋白正确定位到酵母细胞膜上。

 

图片来源于DUAL membrane pairwise interaction kit user manual

 

从载体的图谱上中可以看出，cDNA插入位点（sifI位点）的上游是SUC2，下游是Cub-LexA-VP16。这样表达后诱饵蛋白N端就含有SUC， C端含有Cub-LexA-VP16，诱饵蛋白就能够定位在膜上，并且和互作蛋白的NubG相互作用。

 

3. 若诱饵蛋白是C端在胞质，N端在细胞器腔内（或者胞外），且N端不含信号肽，推荐使用pBT3-STE。

 

 

4. 如果你的诱饵蛋白N端C端均位于胞质，则pBT3-N和pBT3-STE都可以选择。

 

5. 膜体系的猎物（Prey）载体分别为pPR3-N和pPR3-C。NubG在猎物蛋白N端时建议用pPR3-N。NubG在猎物蛋白C端时采用建议用pPR3-C。

 

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