腺病毒包装简介

技术背景：
        腺病毒（Adenovirus，AdV）是一种非整合型双链DNA病毒，在自然界中广泛分布。虽然一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、上呼吸道或眼部上皮细胞的急性感染；但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的，对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。根据Journal of Gene Medicine的统计，截至2006年，在全球1192项基因治疗临床试验方案中，有305项(26%)使用腺病毒载体，首次超过反转录病毒，居第一位。由于腺病毒可以感染呼吸道和消化道，所以它所介导的基因治疗可以静脉注射，还可以通过口服经肠道吸收，或通过喷雾、滴注经呼吸道吸收，使得基因治疗方案易于推广应用。
 
技术原理：
        腺病毒（Adenovirus）是一种无包膜的双链线性DNA病毒，基因组长约36 kb，衣壳呈规则的20面体结构。腺病毒外源基因装载容量大，且能够感染绝大多数哺乳动物细胞，包括分裂和不分裂的细胞；除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。腺病毒适用于在难以转染的细胞中进行RNA干扰、过表达特定基因和in vivo实验。
常用重组腺病毒系统组成：腺病毒骨架载体（携带腺病毒主要功能基因）、穿梭载体（转移外源基因表达盒到骨架载体上）。目前应用最为广泛的是AdMax腺病毒载体系统，骨架质粒和穿梭载体共转染293细胞后，在细胞内中通过Cre/loxP实现载体重组，进而产生重组腺病毒。通过裂解细胞收获病毒粒子，病毒粒子经过反复扩增与纯化可得到高滴度的腺病毒。
 
技术特点
1、 几乎可以感染所有类型的细胞，包括分裂细胞和非分裂细胞；
2、 可以获得复制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒；
3、 病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到10¹²PFU/mL；
4、 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单；
5、 感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。
 
技术应用
1、 应用于体内接种疫苗。用携带免疫调节基因或肿瘤特异抗原已近的腺病毒载体转入相应肿瘤细胞以诱导抗肿瘤免疫反应，可制成具有抗肿瘤活性的瘤苗。
2、 应用于信号转导，基因转位，Co-coIP，动物实验，干细胞研究等科研实验。
3、 可以完成较高难度的克隆构建，包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建，在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。
4、 产生滴度高，非常适于基因治疗。
 
技术流程
1、构建穿梭质粒
以含目的基因的质粒为模板，分别在两个酶切位点设计引物，PCR扩增目的基因，双酶切后插入穿梭质粒。
2、细胞转染
将取骨架质粒和穿梭质粒转染293细胞。
3、将Pac I消化后的腺病毒表达载体转染AD293细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4、将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。
5、收集病毒颗粒分装，-80℃保存。
 
 
腺病毒包装常用质粒图谱