EMSA实验质控要点：对照体系比移位条带更决定结果可靠性

1、先定这张胶要回答哪个问句：直接结合、序列特异、谁在结合、有多强

（1）四种问句对应四套泳道

这事儿吧，一块胶报废最常见的原因不是手抖，而是加样前没把问句定死。动手前先把问句写成一句可判伪的陈述，再倒推泳道表。

问句 A，直接结合吗：至少三道，游离探针（无蛋白，给 free 的迁移基准）、蛋白 + 标记野生型探针、蛋白 + 探针 + 过量非特异核酸。判据是 shift 带出现的同时 free 带相应变淡，两条带的加和大致守恒；只有 shift 亮起来、free 纹丝不动，通常是上样量或曝光差异，不是结合。

问句 B，序列特异吗：在 A 之上叠同源冷探针 10×/50×/100× 三档、突变冷探针 100×，以及标记突变探针平行泳道。判据是同源竞争剂量依赖地把 shift 压下去，100× 突变冷竞争压不动，标记突变探针自身不成带或明显减弱；这三样缺一，「特异」两个字就站不住。

问句 C，谁在结合：加特异抗体做 Supershift，配套同型 IgG 阴性、抗体 + 探针（无蛋白）阴性，必要时用抗原肽阻断或耗竭过的核提取物。问句 D，有多强：换成限量探针下 8~12 点蛋白滴定、配合曝光线性验证，才够格谈 Kd 与 Hill 系数，细节留到第 11 节。

（2）孔位预算与最常见的翻车点

预算也得先算：一块 20 孔胶、每孔上样 10~20 µL、标记探针 5~20 fmol/泳道，还得留 1~2 孔给 free 基准和染料前沿。四种问句想在一块胶上全答，孔位基本不够，硬塞的结果是每个问句都少一个对照。别跟自己较劲，分两块胶、同一批反应液拆开跑，比一块胶凑合可信得多。失败模式很集中：问句不定 → 对照缺组 → 条带没法判 → 整块报废；或者把不同问句的盐浓度、poly(dI·dC) 与蛋白量混着调，组间压根不可比。

图 1｜一块把四个问句压缩到八道的标准胶。第 1 道定 free 基准，第 2 道给 shift 高度，第 3~5 道以冷探针剂量依赖回答「可否竞争」，第 6、7 道切开「序列特异」与「核酸过量」，第 8 道回答「谁在结合」。

2、探针序列设计：长度窗口、位点居中、侧翼碱基与末端标记干扰

（1）长度窗口与侧翼不是随便取的

双链寡核苷酸探针最常用 20~30 bp。短于 18 bp 时核心 motif 两侧几乎没有侧翼，很多蛋白需要接触磷酸骨架才能站稳，shift 会微弱到看不出；长于 40~45 bp 则非特异位点成比例增加，free 与 shift 分不开，核提取物尤其明显。核心 motif 居中，两侧各留 4~8 bp 侧翼，选 GC 40%~60%、无 ≥ 4 连续同聚碱基、ΔG 不深于 −6 kcal/mol 的组合，否则退火后半数是发夹。

退火按等摩尔混合：两条链各取 50~100 µM 储液，在 10 mM Tris pH 7.5、50 mM NaCl、1 mM EDTA 里 95℃ 5 min，再以 0.1℃/s 缓降到 25℃。说白了，退火不完全的单链会跑成 free 上下的杂带，别第一反应就怪蛋白不纯。

（2）末端标记位置会直接改写亲和力

标记优先放 5′ 端，但别贴着结合界面：中间加 3~6 碳 spacer 或 1~2 个无关碱基，把生物素、Cy5 与蛋白接触面拉开。若蛋白正好抓住靠近末端的碱基，一个大染料足以让表观 Kd 偏移 2~5 倍，甚至整条 shift 消失；稳妥做法是 5′ 标记与 3′ 标记各测一次，两次 Kd 相差超过 1.5 倍就换位置或改用内部标记。生物素标记掺入率要求 > 90%，32P 探针比活控制在 1~5×10⁴ cpm/fmol。

纯化别省：HPLC 或变性 PAGE 去掉截短产物与未标记链。游离标记残留，游离生物素、游离 Cy5、未掺入的 γ-³²P-ATP，会把 free 区抬成一片亮，或在 free 下方拖出一条跑得更快的假带，定量时直接污染 θ 的分子。最终按 fmol 计量上样，荧光探针 1~5 fmol/泳道、化学发光与同位素 5~20 fmol/泳道，用 A260 定浓度并折算标记效率。

（3）设计阶段的失败模式

• 有 free 无 shift：先查末端标记是不是压住了结合界面，再查退火与蛋白活性，别直接判「不结合」。
• free 区一片亮或双带：游离标记残留、单链未退火、截短产物，回炉纯化比调胶浓度有用。
• 多条移位带：探针太长带进多个非特异位点，或侧翼形成二级结构，缩短到 24~26 bp 重设计。

3、标记体系取舍：生物素-HRP 化学发光、Cy5/FAM 荧光与 ³²P 同位素

（1）三条成像链路，三种失真

老实讲，标记方式不是灵敏度越高越好，而是看你要定性还是要拟合。生物素 / SA-HRP 化学发光链最长：转膜 → UV 交联 → 封闭 → SA-HRP → 洗膜 → ECL → 曝光，每步都引入失真，内源生物素、非特异吸附、气泡都会成假带。好处是不用同位素、检测限能到 1~5 fmol，样本少、只问「有没有」时够用；坏处是 ECL 线性范围仅 1.5~2 个数量级，曝光 1~60 s 还算线性，再久饱和，饱和片算 θ 会把 Kd 压偏。

Cy5/FAM 荧光胶内直接扫描，省去转膜，线性最宽（2~3 个数量级），双色可把野生型与突变探针放同一道竞争，最适合严格定量；代价是灵敏度略低（Cy5 约 0.5~2 fmol）、染料改变迁移率甚至结合，胶/膜自发荧光抬高背景。³²P 同位素灵敏度最高（可低于 0.1~1 fmol）、磷屏线性 4~5 个数量级、游离标记一目了然，但半衰期 14.3 天、需 γ-³²P-ATP 与 T4 多核苷酸激酶标记、防护与废物处置一样都省不掉，标记探针放一周比活就掉一半。

表 1｜三种标记体系的量级与失真源（典型值，用于选型而非方案）

标记 / 检测	检测限	线性动态范围	主要失真源	更适合的问句
生物素 + SA-HRP + ECL	1~5 fmol	1.5~2 个数量级	转膜不均、曝光饱和、内源生物素	定性有无、样本量小
Cy5 / FAM 荧光扫描	0.5~2 fmol	2~3 个数量级	染料扰动结合、胶/膜自发荧光	Kd 拟合、双色竞争
32P + 磷屏	< 0.1~1 fmol	4~5 个数量级	比活衰减、半衰期、防护合规	低丰度复合物、弱结合

选择逻辑：只判有无用生物素，拟合用荧光或同位素。别在同批定量里混用不同链路：饱和点不同，把 ECL 灰度与磷屏 PSL 放进一条曲线，Hill 系数就没意义。

4、蛋白样品：重组蛋白 vs 核提取物、活性比例、冻融与带入效应

（1）先弄清你加进去的到底有多少「活的」

重组蛋白浓度好定（0.5~5 µM，A280 折算），但挺容易翻车：标签蛋白、复性产物、冻存聚集体里，能结合 DNA 的常只有 30%~70%。拿总蛋白浓度当滴定横坐标，拟合出的 Kd 会整体偏大 2~3 倍。用高亲和位点做化学计量反标，报告写「活性浓度」而非 A280 浓度，拟合才站得住。

核提取物反之：2~10 µg/泳道，成分杂、核酸酶与非特异结合蛋白多，free 天生不干净，更依赖 poly(dI·dC) 与竞争对照。它的好处是复合物更接近天然多亚基状态，Supershift 能一次鉴定多个候选因子。两类样品别混在同一条滴定曲线里，活性比例与背景模型都不同。

（2）冻融、核酸污染与缓冲液带入

反复冻融 3 次以上，shift 常常肉眼可见地变淡，尤其带低复杂度激活结构域的蛋白。分装成 5~10 µL/管、液氮速冻后 −80℃ 保存，用前冰上缓化、不涡旋、不反复回冻；同一批实验里所有泳道用同一冻融代次的蛋白，否则「剂量依赖」可能是降解程度依赖。

A260/280 偏离 1.8~2.0 说明带核酸污染：内源 DNA 抢蛋白，free 不减、shift 偏弱，加蛋白也救不回。

最容易被忽略的是缓冲液带入效应。蛋白储液常含 10%~50% 甘油、150~500 mM NaCl、咪唑与 DTT；在 20 µL 反应里加 2~4 µL 储液，甘油终浓度就能差出好几个百分点，迁移率与介电环境跟着变，条带位置和强度自然不可比。要求各泳道加入的储液体积严格一致，不足用空白缓冲液补齐（buffer equalization），终盐控制在 ≤ 100 mM，超过 150~200 mM 多数复合物当场解离，会被误判成「没结合」。判定清单就三条：同代次、同体积、同终盐。

5、结合反应体系：离子、pH、DTT、甘油与 poly(dI·dC) 用量滴定

（1）一管 20 µL 里的量级

典型体系：10 mM Tris-HCl pH 7.5~8.0、50~100 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5~5 mM MgCl₂、5%~10% 甘油、0.05~0.1 mg/mL BSA 或 0.1% NP-40，标记探针 5~20 fmol，重组蛋白 0.1~2 µg 或核提取物 2~8 µg。单价盐是窄窗口：低于 25 mM 非特异结合抬头，高于 150 mM 特异复合物被压掉，50~100 mM 是大多数体系的落点。Mg²⁺ 对部分蛋白必需，但 ≥ 5~10 mM 会激活核酸酶、加剧 smear，用 1 mM EDTA 把残余二价离子兜住。pH 偏 0.5 个单位，组氨酸/半胱氨酸参与的组合就能让 shift 强度差一倍；DTT 0.5~2 mM 维持还原态，氧化后蛋白聚集，直接表现为井底残留。

（2）poly(dI·dC) 滴定：这词是本节的题眼

poly(dI·dC)·poly(dI·dC) 是压非特异的核心变量，用量必须滴定而不是照抄配方。做 0 / 0.05 / 0.1 / 0.25 / 0.5 / 1 / 2 µg 每 20 µL 的七点梯度：核提取物通常落在 0.5~1 µg，重组蛋白可降到 0.05~0.1 µg 甚至不加。判据是「shift 保留、free 区干净、拖尾最短」三者同时满足的窗口。加太少，整片 smear 加多条非特异带；加太多，连特异复合物一起被竞争掉，shift 假阴性，低亲和体系尤其惨。poly(dI·dC) 批次差异大，换批重滴；鲑鱼精 DNA 可替代，肝素 0.5~5 µg/mL 是更强的竞争剂，对碱性蛋白常常把真信号一起压没，别当万能背景清洁剂。

加样顺序也定死：buffer + 水 + poly(dI·dC) + 非标记竞争物先混，加蛋白后 4℃ 或室温放 10 min 让非特异位点被先占住，最后才加标记探针，20~25℃（或 4℃）孵育 20~30 min。图省事把探针和蛋白一起丢进去，探针会先被非特异蛋白锁住，竞争实验的剂量梯度就全乱了。平衡别靠猜：做 5/10/20/40/60 min 梯度，θ 不再上升才算到，一般 20~30 min，弱结合或低温放到 60 min；把未平衡早期点读成「亲和力差」最常见。

调参提醒别一见背景脏就猛加 poly(dI·dC)，它分不清「不要的蛋白」和「要的复合物」，加过头连真带一起吃掉。先小跨度滴七点，找到 free 刚变干净、shift 还没开始掉的那个窄窗口；顺带把蛋白储液带入体积补齐，否则你以为在滴 poly(dI·dC)，其实滴的是甘油。

6、非变性凝胶与电泳条件：交联比、0.5×TBE、低温、电压与终点

（1）胶浓度决定复合物进不进得去

非变性聚丙烯酰胺常用 4%~6%，交联比 29:1 到 37.5:1（丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺）。孔径随浓度与交联比变：超过 8% 时大复合物进不了胶，全堆在加样孔，像「结合太强」，其实是筛不进去；低于 4% 胶软、free 与 shift 的迁移率差被摊薄，两条带分不开。多数单因子体系 5%、29:1 是起点，复合物分子量偏大就降到 4%。

预电泳别省：4℃、0.5×TBE、100 V 预跑 30~60 min，把过硫酸铵残留、未聚合单体和离子前沿清掉，同时把胶内 pH 稳定下来。跑胶缓冲液固定 0.5×TBE（约 45 mM Tris-硼酸、1 mM EDTA，pH 8.0~8.3），不用 1×（发热翻倍）、别换 TAE（缓冲容量弱，长跑后 pH 漂移，复合物在胶里解离）。上下槽必须同批同浓度，跑超过 2 h 建议中途换液或循环。

（2）低温、电压与终点判断

4℃ 冷室或外接循环冷却，胶内实际温度压在 15℃ 以下；温度每升 10℃，复合物解离速率大致翻倍，表现为 shift 变淡、后方拖尾变长，也就是常说的「胶内解离」假象。恒压 100~150 V（约 8~10 V/cm）是常规区间，大板可到 200 V 但必须强冷却；电压过高出现微笑条带与整片 smear，过低则扩散让条带变宽。上样缓冲只含 5%~10% 甘油与 0.5×TBE，绝不能带 SDS、β-巯基乙醇或加热变性，不涡旋、吹打混匀即可。

终点看三个信号：溴酚蓝跑到胶长 2/3~3/4（通常 1.5~2.5 h）、free 与 shift 分开 ≥ 3~5 mm、free 还没出胶。要命的是别等染料跑出胶才停，free probe 会直接丢进下槽，整块胶既没法算 θ 也没法证明上样量一致。

图 2｜从配管到曝光的完整链路，以及每段最该盯的那个数。定量的误差往往不是拟合算法给的，而是这条链路上某一环已经把信号压出了线性区。

7、转膜交联与检测：带电尼龙膜、UV 能量、封闭与曝光线性区间

（1）转膜与交联：把胶上的分布原样搬上膜

生物素体系要把带负电的 DNA-蛋白复合物转到带正电尼龙膜（0.45 µm），0.5×TBE、4℃、湿转恒流 300~400 mA 或恒压 100 V，30~60 min；半干转时间短但更易不均。转膜不均的典型图谱是边缘亮中间暗、条带弯曲，局部甚至整块缺信号；转过头则 20~30 bp 的小探针直接穿膜丢掉，free 区空空如也，θ 的分母直接没了。转完在膜背面用铅笔标记泳道和方向，别等显影后靠猜。

紫外交联常用 254 nm、120 mJ/cm²（约 30~60 s，按交联仪实际剂量标定），可在 80~150 mJ/cm² 间优化。能量不足，探针在后面洗膜里被洗掉，信号整体发虚；能量过头，胸腺嘧啶二聚体与蛋白-DNA 过度交联会把背景抬起来，还可能破坏后续要识别的蛋白表位。也可 80℃ 烘烤 30~60 min 或 302 nm 长波备选，但同一批实验只能锁一种条件。

（2）封闭、洗膜与曝光的线性

封闭用 3%~5% BSA（或脱脂奶粉）+ 0.1% Tween-20 的 TBST，室温 30~60 min；SA-HRP 按 1:1000~1:5000 孵育 30~60 min，TBST 洗 3~4 次、每次 5 min。封闭不足是整片高背景首因，Tween 过头或洗太狠则信号偏弱，两者都把剂量依赖压平。还有个隐蔽坑：抗体或蛋白储液里的叠氮钠会灭活 HRP，叠氮钠 0.02%~0.1% 就能让整张膜不出信号，相关试剂须透析换液或选无叠氮钠配方。

曝光前先做 5/15/30/60/120 s 的曝光系列，挑灰度与曝光时间成正比、且 16-bit 像素没触顶（远低于 65535）的那张来定量；同一批所有泳道必须同一张膜、同一次曝光，绝不能「这条带淡就单独多曝一会儿」。信号一旦饱和，强带的增长被削平、弱带被噪声吞掉，θ 被系统性压缩，第 11 节拟合出的 Kd 和 Hill 系数全废。

8、竞争实验：冷探针 10×/50×/100× 梯度、突变探针与 IC50 读法

（1）梯度怎么排、每档该长什么样

冷探针就是未标记、序列相同的双链探针，倍数相对标记探针摩尔量算：标记探针 10 fmol 时，10×/50×/100× 分别加 100/500/1000 fmol。合理的图谱是剂量依赖：10× 时 shift 还剩 60%~80%，50× 压到 20%~40%，100× 接近消失（< 10%）且 free 相应回补。10× 一下就全压掉，多半是特异结合本来就很弱、或标记探针浓度标定错了；100× 还剩一半，则要怀疑存在不可竞争的非特异结合，或复合物 k_off 极小、孵育时间没到解离平衡，别急着下「亲和力极高」的结论。

光有同源竞争不够，还得配三道对照：突变冷探针 100×、异源冷探针 100×（都压不动）、标记突变探针平行泳道（自身减弱或不成带）。少了突变冷竞争，「被压掉」有可能只是核酸总量把蛋白稀释掉了，跟序列特异没关系。突变设计要克制：核心 motif 里换 2~4 个关键碱基（如 5′-GGAA-3′ → 5′-GGCA-3′），保持长度、GC 含量与侧翼完全一致，避免顺带改了二级结构；突变体与野生型同批退火、同批标记，标记效率差超过 10% 就得重做。

表 2｜八泳道竞争 / 突变 / Supershift 分组与预期判读（对应图 1）

泳道	关键组分	预期图谱	不满足时说明什么
1	仅标记 WT 探针	只有 free，定迁移基准	出现高位带＝探针污染或自发聚集
2	WT 探针 + 蛋白	free 减少、出现 shift	无 shift＝失活、盐过高或标记干扰
3	+ 同源冷探针 10×	shift 剩 60%~80%	直接归零＝特异结合过弱
4	+ 同源冷探针 50×	shift 剩 20%~40%	不下降＝冷探针量算错或已饱和
5	+ 同源冷探针 100×	shift 近消失、free 回补	残留明显＝不可竞争的非特异成分
6	标记突变探针 + 蛋白	无 shift 或显著减弱	仍有强带＝结合不依赖该 motif
7	WT + 突变冷探针 100×	shift 基本保留	被压掉＝竞争只是核酸量效应
8	+ 特异抗体	更靠上的 supershift	不出现＝见第 9 节三种解释

要做相对亲和力，把冷探针铺成 0.1×~1000× 的 8~12 点对数梯度，画「shift 分数 对 log[冷探针]」拟合 IC50。但 IC50 不是 Kd：它随探针浓度浮动，越接近 Kd 越被抬高（Cheng-Prusoff 逻辑），只适合同批内比野生型与突变体，别跨批当绝对亲和力报。

9、Supershift：抗体表位可及性、加入顺序与「不超迁移」的三种解释

（1）抗体得先够得着表位

Supershift 的前提是抗体能认出复合物状态下仍然暴露的那个表位。针对 DNA 结合域的抗体常翻车：该域被探针占着，抗体贴不上，于是「蛋白在、shift 在、就是没超迁移带」。换识别 N 端、C 端或柔连接区的抗体，重组体系干脆用抗标签抗体（anti-His / anti-Flag / anti-HA）最稳；核提取物没有标签，只能靠 2~3 株识别不同表位的抗体交叉验证。顺带把抗体储液里的叠氮钠换掉，否则第 7 节的 HRP 链路会直接黑屏。

加入顺序和剂量都影响结论。标准顺序是蛋白与探针先孵 20~30 min 让复合物成形，再加抗体 4℃ 继续 20~60 min；也有人先让抗体和蛋白预孵再加探针。两条路结果未必一致（预孵可能直接阻断结合），所以一个项目里只能锁一种并写进方法。抗体做 0.2/0.5/1/2 µg 每反应的剂量梯度：太少不足以拖慢迁移、只看到 shift 略淡；太多会形成大免疫复合物，干脆滞留在加样孔里，free 与 shift 一起消失，图上看着像「全结合了」，其实啥也没跑进去。

（2）超迁移带不出现，先别判阴性

至少三种解释：① 表位被遮蔽或抗体只认变性构象（换表位、换抗体、换标签体系）；② 目标蛋白压根不在这个复合物里（真阴性，需换候选因子、或用质谱/耗竭核提取物佐证）；③ 抗体把复合物拆了、或把它拖在孔里（判据是加样孔有强信号、free 减少，而不是在 shift 上方多出一条带）。靠三道控制分开：同型 IgG 阴性、阳性抗体对照、抗原肽预阻断（应消掉 supershift）。只看到 shift 整体变淡不算 supershift，那更可能是抗体非特异吸附或体积稀释。

判读提醒别慌，supershift 没出来不等于「这个蛋白没结合」。更多情况是抗体挑错了表位，或者加得太猛把复合物摁在孔底。先把同型 IgG 和抗原肽阻断摆齐，再换一株识别另一端的抗体；三道控制都干净、换抗体仍无超迁移，才轮到「目标蛋白不在复合物里」这个结论。

10、泳道图谱判读：游离探针、多条移位带、减弱与消失的区别

（1）先把 free 这条基准看懂

free 是所有迁移率的尺子，理想状态是一条紧、亮、不带尾的带。free 变宽或向下拖尾，先查上样盐与甘油、探针是否被核酸酶啃过、以及胶内解离，别一上来就归因于蛋白；free 整条消失，多半是染料前沿跑出胶或探针量算错，此时连上样一致性都证明不了，后面所有定量都作废。单条 shift 提示单一化学计量，但单带不等于单一蛋白，共迁移复合物能叠成一条，得靠抗体或耗竭去拆。

（2）多条带、减弱与消失

多条移位带通常三类来源：不同寡聚态、异源复合物、探针降解或标记不均。分辨靠蛋白滴定：高位带随蛋白浓度单调增强、低位带同步减弱，更像多聚化；各带比例不随浓度变化，更像异源复合物；带型在不同批次间乱跳，则是探针质量问题。「减弱」与「消失」要分开：减弱是占据分数下降，消失常是胶内解离或压进孔底，两者在饱和片上一模一样，须回到线性区间重看。

判读固定四步：free 守恒 → shift 位置与条数 → 竞争剂量依赖 → supershift。倒过来读，最容易把加样孔里的非特异滞留当成漂亮阳性。清单化之后每条带都能对上一个可查的原因，而不是「感觉结合挺强」。

11、定量 EMSA：限量探针、θ 拟合、Hill 系数与紧结合二次方程

（1）限量探针是拟合成立的前提

拟合 Kd 要求探针远小于 Kd（≤ 0.1·Kd，1~20 fmol/20 µL，约 0.05~1 nM），游离蛋白才近似等于总蛋白，不用解质量守恒。探针浓度与 Kd 相当或更高时会 titration 掉蛋白，θ 曲线右移、Kd 被高估，「比文献低一个数量级」常根子在此。蛋白做 8~12 点梯度覆盖 θ≈0.05~0.95，按 1.5~2 倍或对数等距（0.1~50 nM），≥3 次独立重复，同批同膜同曝光。

θ 的定义是 θ = bound/(bound + free)，用磷屏、荧光或线性 ECL 分别积分 shift 与 free 两条带，按 θ = I_shift/(I_shift + I_free) 算，绝不能只拿 shift 的亮度当结合量，上样量差 10% 就能骗出一个假的平台。转膜不均或染料淬灭会让两带响应系数不同，用已知比例标记探针混合液校正一次。

（2）Hill 拟合、紧结合解与误差账

把 θ 对 log[P] 作图，用 Hill 形式 θ = [P]n/(Kdn + [P]n) 非线性拟合，同时给 Kd 和 Hill 系数 n。n > 1 提示协同或寡聚化依赖，n < 1 提示位点异质、负协同或胶内解离，但 n 对曝光饱和与点位数极敏感，别单凭它下机制结论。当 [D]0 与 Kd 可比、进入配体耗尽区，必须改用质量守恒的二次方程解：

θ = (P0 + D0 + Kd − √((P0 + D0 + Kd)² − 4·P0·D0)) / (2·D0)

这就是紧结合（tight-binding）情形该用的式子，硬套 n=1 的简单双曲线会把 Kd 抬到离谱。非变性胶条件也直接进误差账：k_off 复合物在跑胶途中解离会拖尾，表观 Kd 大于溶液真值，4℃、低电压、4% 胶、跑胶减半可缓解；把跑胶时间减半后 shift 明显增强，就说明你量到的是解离而不是弱结合。误差来源按权重排：活性蛋白比例、曝光饱和、上样量、转膜不均、胶内解离、非特异结合未扣、点位数不足。

图 3｜限量探针下的滴定与拟合联动。左边每一道对应右边曲线上的一个点，free 与 shift 必须成对积分；右边半饱和处的横坐标才是 Kd 的读数，曲线陡峭程度对应 n。

拟合提醒别把 θ 曲线拉成直线就报 Kd，绕不开三件事：探针是否真「限量」、曝光是否在线性区、蛋白标的是总浓度还是活性浓度。这三样只要错一个，非线性拟合给出的就不是亲和力，而是一份排版工整的错觉。

12、异常图谱与 RNA EMSA：拖尾、井底残留、胶内解离与 RNase 控制

（1）四种异常图谱各有各的调参动作

踩过坑的人都明白，异常图谱不是「运气差」，每一款都对应一个可定位的变量。把现象、原因、动作、验证方式列成表，比翻来覆去换蛋白管用。图 4 把四种典型摆在一起对照，下面这张表给的是可直接照做的动作和量级。

表 3｜异常图谱排查表（现象 → 原因 → 调参动作 → 验证方式）

现象	最常见原因	调参动作	怎么确认修好了
竖向拖尾 smear	上样盐 > 100 mM、甘油 > 10%、poly(dI·dC) 不足、电压过高	脱盐或稀释储液、甘油降至 5%、补 poly(dI·dC)、降到 100 V 并强冷却	free 收成紧带、shift 后方尾长 < 3 mm
井底 / 加样孔强信号	复合物过大进不了胶、抗体过量、蛋白氧化聚集、核酸污染成网	胶降到 4%、抗体减到 0.5 µg、DTT 提到 2 mM、核酸酶处理后离心取上清	孔信号消失、shift 回到胶中上部
多条非特异带	探针 > 40 bp 含隐性位点、poly(dI·dC) 太少、核提取物过量	探针缩到 24~26 bp、滴定 poly(dI·dC)、核提取物降到 2~4 µg	只剩一条可被 100× 冷探针压掉的带
整片高背景	封闭不足、SA-HRP 过浓、洗膜不够、曝光过久	5% BSA 封闭 60 min、HRP 稀释到 1:5000、洗 4×5 min、曝光缩到 30 s 内	膜空白区灰度接近本底、无像素饱和

复合物在胶内解离值得单拎：k_off 大的体系，shift 会在迁移途中松开，形成从 shift 拖向 free 的一片竖雾，看上去像「结合很弱」。判据很直接，把跑胶时间减半，若 shift 明显增强、拖尾变短，就是解离；若毫无变化，才回去怀疑亲和力本身。

（2）RNA EMSA 与修饰依赖比较

换成 RNA 探针，多出两件事要管。一是二级结构：体外转录产物先 65℃ 5 min 变性再缓降折叠，或在含 Mg²⁺ 缓冲液里 37℃ 折叠 10~20 min；Mg²⁺ 0.5~2 mM 对茎环和部分 RBP 结合是必需的，但 ≥ 5 mM 会加剧降解与非特异。二是 RNase：所有缓冲液 DEPC 处理、加 0.5~1 U/µL RNase 抑制剂、跑胶前后设「探针 + 无蛋白」泳道，若这道自己就 smear，是 RNase 污染而非结合。3′ 端可用 pCp-生物素标记、5′ 端用荧光标记，注意 T7/SP6 转录产物的 5′ 三磷酸会影响某些 RBP 识别。

做 m⁶A、Ψ 之类修饰依赖结合比较，修饰与未修饰探针必须同批转录、同批标记、同批折叠，Kd 差异 ≥ 2~3 倍且三次重复方向一致才敢说「依赖修饰」。修饰核苷常同时改变标记效率与折叠 ΔG，须先确认两者构象接近，否则量到的是构象差异而非修饰读取。

图 4｜四种异常图谱的对照卡。把这张图和表 3 对着用，改一个变量、看一个指标，别一次动三四个条件，否则修好了也不知道是哪个起效。

13、证据链与结论边界：与 ChIP、报告基因、SPR/ITC 的分工

（1）每种实验只回答自己那一层的问题

EMSA 给的是体外、限定序列、限定缓冲液里能否形成可竞争、可鉴定、可定量的复合物，以及它的 Kd 与 Hill 系数。ChIP / CUT&RUN 回答体内染色质环境下的占据，但受交联、抗体特异性与几百 bp 分辨率限制，单独不能证明「直接结合」；报告基因与位点突变回答细胞内的功能读出，却混着转染效率、通路冗余和染色质状态；SPR / ITC / MST 给无标记溶液相的 k_on/k_off 与热力学量，仍不告诉你在核里到底占没占；测序与 motif 扫描只是候选位点清单，必须靠前面几层去验。到头来，把 EMSA 的一条 shift 直接写成「该因子在体内直接调控此基因」，是越过三四层证据的跳跃。

体外 Kd 20 nM 也不等于细胞内被占据：没有核小体遮挡、没有全基因组竞争位点、没有相分离浓缩，蛋白浓度与修饰状态全不同，核提取物里还可能是被别的蛋白桥接上来的间接结合。EMSA 答不了「是否直接」「是否生理」「是否有功能方向」，它答得了的只有那一管里的复合物行为。承认这条边界，结论反而更硬。

（2）交付判定清单

1. 问句与对照：四种问句选其一，free 基准、无蛋白阴性、buffer equalization 齐备，泳道表与判据事先写定。
2. 探针：20~30 bp、位点居中、末端标记已验证不扰结合、退火完全、HPLC 纯化、游离标记残留已清。
3. 特异：同源冷探针 10×/50×/100× 剂量依赖、突变冷探针 100× 压不动、标记突变探针平行减弱，三者同批成立。
4. 身份：Supershift 有同型 IgG、抗原肽阻断、至少两株不同表位抗体交叉，或耗竭/质谱佐证。
5. 定量：探针限量、8~12 点滴定、3 次独立重复、曝光在线性区，n=1 与二次方程两种拟合都跑过并说明选哪个。
6. 边界：结论只写到「体外形成复合物」这一层；体内占据、直接性与功能另找 ChIP、报告基因、SPR/ITC 或扰动实验闭环。

一张胶最值钱的从来不是那条被抬高了的带，而是它旁边那七八条把「巧合」逐一排除掉的对照。把对照补齐、把线性区守住、把边界写清楚，EMSA 才从一张好看的图变成一条能被别人复核的证据链。