单克隆抗体的制备过程两次筛选的原理

    单克隆抗体是由单一的B细胞分泌的特异性抗体，对于科学研究、医学诊断和治疗具有重要的应用价值。单克隆抗体制备过程包括两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。本篇文章将详细介绍单克隆抗体制备过程两次筛选的原理。

第一次筛选

    细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。在体外条件下实现B细胞和肿瘤细胞的杂交，产生一种新型细胞，称为杂交瘤细胞。由于杂交瘤细胞同时具有B细胞的抗原识别和分泌大量抗体的能力，成为大规模制备单克隆抗体的主要来源之一。但是，在杂交瘤细胞中，往往存在着未融合的B淋巴细胞和肿瘤细胞，以及不具有生长潜力的混合体细胞，这些细胞的存在会影响到单克隆抗体的制备效率和质量。

    因此，在第一次筛选中，需要针对杂交瘤细胞进行选择性培养。常用的HAT (Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine) 培养基就是一种含有三种生长限制因子的无血清选择培养基，它能够杀死未融合的B淋巴细胞和肿瘤细胞，以及不具有生长潜力的混合体细胞。其中，次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶三种生长限制因子的作用机理如下：

    次黄嘌呤是一种DNA合成物质，可促进DNA合成过程中嘌呤核苷酸的代谢，并作为DNA分子中嘌呤核苷酸的前体，但大部分动物细胞都不能自行合成次黄嘌呤，只能靠外界供应。杂交瘤细胞能够利用次黄嘌呤进行DNA复制和细胞增殖，但未融合的B细胞和肿瘤细胞则不能。

    氨甲喋呤是一种DNA合成物质的拮抗剂，可以干扰细胞合成DNA过程。在HAT培养基中，氨甲喋呤能杀死未融合的B细胞和肿瘤细胞，只有杂交瘤细胞能够克服这种阻力。

    胸腺嘧啶是一种嘧啶类似物，也是一个生长限制因子。在HAT培养基中，通过胸腺嘧啶的作用，可进一步筛选出那些扩增了源自B细胞的抗体基因的杂交瘤细胞。

    利用HAT培养基的筛选方法，在第一次培养后，只有杂交瘤细胞能够生长并形成单克隆，从而得到大量的同一株杂交瘤细胞。但是，在这一过程中，已经存在有部分杂交瘤细胞仍然不能产生特异性抗体，需要进一步筛选。

第二次筛选

    在第一次筛选后，杂交瘤细胞可以分泌大量的抗体，但其中可能混杂着非特异性的抗体或者无效的单克隆。因此，需要利用抗原对杂交瘤细胞进行二次筛选，筛选出具有特异性的单克隆抗体。

    二次筛选通常分为两种方法，流式细胞术和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）。

    流式细胞术是一种高通量的细胞分析技术，可以在单个细胞水平上评估其表型和生理状态，包括细胞增殖、生存期、活化状态等。在单克隆抗体制备中，利用流式细胞术可以将细胞内外标记，通过荧光激发和探测器检测，实现单个细胞的分离和分析。